细胞培养基本技术-研究生-2019级

细胞培养基本技术硕士研究生2019级生命科学学院医学遗传与细胞生物学教研室2019年12月6日内容1.细胞培养基本概念2.细胞培养实验准备基本仪器和液体3.细胞传代4.细胞活力的检测5.细胞冻存、复苏、运输和短期保存6.原代培养（视频）细胞培养基本概念Part1细胞培养的基本概念•原代培养：直接取自生物体的细胞、组织或器官开始的、在首次传代培养之前的培养；•传代培养：原代细胞或细胞株或细胞系需在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的原代细胞或细胞株或细胞系或得到大量的同种细胞，并维持细胞种的延续，这个体外培养过程称为传代细胞培养。•器官培养：使用器官原基或器官的一部分或整个器宫维持和生长，某种程度上可以允许分化并保存器官的构筑和功能；•组织培养：使用组织块（O.5～1立方毫米）或薄片（厚0.2毫米）体外维持；•细胞培养：通过自发迁移或机械的、酶解的方式从母体组织分离出来的细胞的生长；培养细胞的生命归宿传代期衰退期原代培养期•细胞系cellline：原代培养物经首次传代成功后即成细胞系；•有限细胞系：如果细胞系不能继续传代或传代数有限，称为有限细胞系（finitecellline），它由原代培养中的许多细胞系列组成；•连续细胞系：如细胞系可连续传代，则称为连续细胞系（continuouscellline），即已建成的细胞系（establishedcellline）；细胞株cellstrain：通过筛选或克隆化，且有特殊性质或特异标记的细胞，这些特性在以后的培养中必须持续存在。再由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株。细胞系或细胞株的命名以供体患者的姓名命名：HeLa（来源于宫颈癌）以时间地点来命名：CHO中国仓鼠卵巢细胞（ChineseHamsterOvary）宫-743：宫颈癌上皮细胞，1974年3月建立NIH3T3：美国国立卫生研究院（NationalInstituteofHealth）建立，每3天传代，每次接种3×105细胞／ml以组织来源命名：如BHK(幼地鼠肾细胞)以临床疾病类型命名：如BALL-1细胞系(来自B淋巴细胞急性白血病人白细胞)培养细胞的特性体外培养动物细胞的生长方式：–贴附型生长：必须贴附于支持物表面才能生长：上皮细胞型、成纤维细胞型、游走细胞型。–悬浮型生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞体外培养细胞大致分为四型：•成纤维细胞型•上皮细胞型•游走细胞型•多形细胞型起源于网状内皮系统的细胞皆属本型。细胞散在生长，常活跃地游走或做变形运动，速度快面且方向不规则，一般不连接成片。此型细胞不稳定，有时难与其它型细胞区别若受培养基影响，它们也可能呈成纤维细胞形态。神经细胞属于本型。游离期贴壁期潜伏期对数生长期停止期（平台期）游离期：•细胞接种后在培养液中呈悬浮状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形；贴壁期：•细胞附着于底物上，游离期结束；•底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等；•血清：有促使细胞贴壁的冷析球蛋白（CIG）和纤黏素（FN）、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着；•塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团）每代贴附生长细胞的生长过程潜伏期•此时细胞有生长话动，而无细胞分裂。初代培养细胞潜伏期长，一般为24-96小时或更长。细胞株潜伏期较短，一般为6～24小时；指数生长期•细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究；•接触抑制（contactinhibition）、密度抑制（densityinhibition)停止期（平台期）：•细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂；指数生长期是最佳实验期!培养细胞生长的必要条件1.细胞的营养需要2.细胞的生存环境–温度:37℃–O2–CO2:5%CO2+H2O←→H2CO3←→H++HCO3-–pH:7.2-7.4–渗透压3.无污染4.无毒细胞培养实验准备基本仪器和液体Part2实验准备1.实验用品及所在空间：一般实验空间：•压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸•酶标仪、微孔板震荡器•液氮罐•自动双重纯水蒸馏器，纯水仪缓冲间•不是马上使用的耗材（培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板，冻存管）洁净间：•超净工作台、•CO2培养箱、倒置显微镜、•耗材（培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板，冻存管）超净台超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒，使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面，使工作台内构成无菌环境；平均风速如果达不到0.32米/秒时，需要更换高效过滤器；注意安装在洁净间内，定期清洁。CO2培养箱CO2培养箱设定的条件为37℃，5％CO2；使用时应注意的问题：①用螺旋口瓶培养细胞时，需将瓶盖微松，以保证通气。②保持培养箱内空气干净。定期消毒（90℃，14h)。③箱内加灭菌蒸馏水3000毫升于蒸馏水槽中以保持箱内湿度，避兔培养液蒸发。•主要用于冻存细胞、组织块等活性材料；•液氮是超低温液体（-196℃），在灌冲和取出液氮时，都应该有防护，以免液氮飞溅伤人；•容器如果颈部如有出汗，或白霜，说明容器真空已经损坏，需要更换；注意液氮的储量，记忆总容量的1/3时需要补充；•实验室应有机动液氮罐，每年应对液氮罐内胆进行清洁。液氮生物容器（液氮罐）压力蒸汽消毒器：湿热消毒，用途广，注意：不要忘记检测水位；电热干燥箱：烘干（湿热消毒后）、干热消毒（160℃，2小时）。主要用于玻璃器皿消毒。注意：长时间离开要关掉电源；紫外灯：紫外线消毒，主要用于培养室空气、操作台、塑料培养皿和培养板等表面消毒。倒置显微镜滤器玻璃器皿：培养瓶、培养皿、试剂瓶、移液管、离心管等塑料品金属器械：解剖刀、眼科剪、镊子（直头或弯头）、中号圆头镊等杂用品：金属饭盒、试管架、胶塞（各种规格）、记号笔、吸头等常用实验器材•浸泡、刷洗、酸泡、•流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50℃烘干，待包装常用玻璃器皿清洗实验1.1、实验1.2新的玻璃器皿的清洗灭菌•自来水刷洗，除去灰尘；•烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物；•刷洗、烘干：泡盐酸12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干；•泡酸、清洗：用酸液浸泡12小时，然后从酸缸内捞出器皿用自来水冲洗10次，最后蒸馏水冲洗3-5次；•烘干、包装；•高压灭菌；•烘干备用使用后的玻璃器皿的清洗灭菌•刷洗、烘干：使用过的玻璃器皿立即用清水刷洗干净；•自来水浸泡过夜，泡酸前用自来水冲洗干净，烘干；•泡酸、清洗：烘干后泡入酸液，12小时后从酸缸内捞出器皿立即用自来水冲洗10次（避免蛋白质干涸后粘附于玻璃上难以清洗），过蒸馏水3次；•烘干、包装；•高压灭菌；•烘干备用金属器皿•金属器皿不能泡酸；•洗消时可先用洗涤剂刷洗，后用自来水冲干净，然后用75％酒精擦拭，再用自来水，然后用蒸馏水冲洗；•再烘干或空气中晾干；•放入铝制盒内或单独包装好，高压灭菌，再烘干备用。橡胶和塑料•刷洗、烘干：使用后立即用清水刷洗干净•自来水浸泡过夜，泡酸前用自来水冲洗干净烘干。•泡入5％盐酸过夜。•自来水冲洗10次，过蒸馏水3次•烘干•高压蒸汽灭菌•烘干备用•滴管胶头可用75％酒精浸泡5分钟，紫外线照射消毒。包装、消毒实验1.3消毒前进行包扎小包装，封闭使用端；消毒（各种器械、可以高温消毒的液体）湿热消毒使用压力蒸汽灭菌器，被消毒物品间需要留有空隙，便于蒸汽流动；液体消毒时，使用棉塞或是插有针头的胶塞封瓶；一般物品（布类、金属器械、玻璃器皿）15磅20分钟，橡胶制品10磅10分钟，常规液体15磅15分钟；灭菌完毕后，不要急于取出消毒品，利用余热去除部分湿气，半小时后移入干燥箱烘干。2.动物细胞培养用液平衡盐溶液；培养基（天然和合成）；消化液；血清•使用新鲜三蒸水配置；•人工合成培养基的基础用液，主要成分是无机盐和葡萄糖，少量酚红作为溶液酸碱度变化的指示剂（酚红对细胞有一定毒性，也有低浓度或是不带酚红的BSS液）；•Hanks和Earle液是多数培养液的基础溶液，二者主要区别在于缓冲能力不同；•BSS液中各实际规格为一级GR试剂或是二级AR试剂平衡盐溶液BalancedSaltSolution,BSS培养基培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基：天然培养基：有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）；优点：营养成分丰富，培养效果好；缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污染合成培养基:根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等；合成培养基主要成分是氨基酸（谷氨酰胺）、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质（嘌呤、嘧啶、辅酶A等）；人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。完全培养基的组成细胞生长培养液细胞维持培养液基础培养液80-90%95%血清10-20%5%谷氨酰胺（200毫摩尔/升）1毫升1毫升青、链霉素每100单位/毫升每100单位/毫升谷氨酰胺细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。一般培养液中谷氨酰胺的含量为1～4mmol/L。谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4℃放置1周可分解50％，故应单独配制，置于-20℃保存，临用前加入培养液。配制方法：谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20℃保存，使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清有胎牛血清FBS、新生牛血清NBS、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好；优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。血清的灭活（消除补体活性）：56℃，30分钟血清的除菌：过滤除菌40nm-0.22mm微孔滤膜血清胰蛋白酶浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞；•胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％，用滤器过滤除菌，分装，-20℃保存；•胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。如难以消化，可用0.2%EDTA-PBSbuffer先浸泡细胞5-30分钟；•用含血清培养液终止其对细胞的消化作用;EDTA化学螯合剂，商品名VERSENE液，使用浓度0.02%，消化后需要彻底去除；胰酶-EDTA消化液终浓度分别为0.25%和0.02%；胶原酶不同来源的胶原酶的活性和种类，纯度不同，需要参考文献，使用浓度一般1-5mg/ml。消化液细胞传代Part3细胞传代方法根据细胞生长的特点，传代方法有3种：1.悬浮生长细胞传代•离心法传代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。•直接传代法：悬浮细胞沉淀在瓶壁时，将上清培养液去除1/2一2/3，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代；2.半悬浮生长细胞传代（Hela细胞）•此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，进行传代；3.贴壁生长细胞传代•采用酶消化法传代。常用的消化液有0.25％的胰蛋白酶液。贴壁生长细胞传代方法：1.吸光培养瓶中的培养液；2.PBS洗一次；3.加入1-2ml0.25％的胰蛋白酶液(以消化液能覆盖整个瓶底为准），静置2-10min（显微镜下动态监测，细胞收缩变圆则需要停止消化）；4.吸去胰蛋白酶液，加入完全培养液；5.用吸管吸取瓶内培养液，反复吹打瓶壁细胞，形成细胞悬液；6.吸取1/10—1/40细胞悬液（实际接种比例应依据所收获实际细胞密度来定），接种于新的培养瓶内；7.加适量新鲜培养液于接种了细胞悬液的