Bradford法测蛋白质浓度

Bradford法测蛋白质浓度一、实验原理考马斯亮蓝（CBB）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质—色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。该法试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1000μg/ml，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。二、试剂配制10ml标准蛋白溶液浓度：1mg/ml牛血清蛋白配置：用十万分之一天平称取0.01g牛血清蛋白(98%)倒入10ml容量瓶中，用0.15MNaCl溶液定容至10ml，室温下充分混合溶解1小时，10000rpm离心半分钟，取上清液。500mL染色剂浓度：0.01%（w/v）G250，8.5%磷酸和4.75%乙醇配置：用千分之一天平称取0.05gG250于烧杯中，加入25mL95%乙醇，使用搅拌子搅拌，再量取50mL85%的磷酸溶液，最后去离子水定容至500mL。配好后用Whatman1号滤纸过滤。保存：在常温条件保存在棕色试剂瓶中三个月，但这段时间可能会出现染料的沉淀，所以每次使用前需混合均匀。二、保存条件保存：在常温条件保存在棕色试剂瓶中三个月，但这段时间可能会出现染料的沉淀，所以每次使用前需混合均匀。三、实验过程1.提前至少半小时打开紫外分光光度计或者酶标仪2.配制蛋白标准溶液先配制1mg/ml的牛血清蛋白（BSA）母液，再往母液中加入磷酸缓冲溶液（PBS）配制一组浓度分别为1.0mg/ml，0.8mg/ml，0.4mg/ml，0.2mg/ml，0.1mg/ml的BSA溶液100μL，计算稀释各组需要的BSA溶液及PBS溶液的体积。BSA体积（ul）01020406080100PBS体积（ul）10090806040200BSA浓度（mg/ml）00.10.20.40.60.81.03.将配置好的不同浓度蛋白标准溶液30μL加到1mLBradford工作液中，轻轻颠倒混匀，静止5min。4.将适量体积的样品用PBS稀释至30mL，加入1mLBradford工作液中，轻轻颠倒混匀，静止5min。注：样品稀释倍数需要根据原始样品的浓度进行适量调整，一般保证稀释后样品浓度在0.1-1.0mg/ml，所以测浓度之间可以简单的估计一下浓度范围，一般情况需要稀释10左右。5.将反应好的溶液300μL加入到96孔板的样品孔中。6.使用紫外分光光度计或酶标仪测定A595nm吸光度。根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。四、实验数据及处理测得三次重复实验BSA溶液的吸光度如下：编号吸光度1吸光度2吸光度3平均吸光度浓度(mg/mL)10.0000.0000.0000.0000.0020.1270.1240.1260.1260.1030.2450.2420.2480.2450.2040.4160.4180.4070.4140.4050.5660.5650.5520.5610.6060.7810.7860.7680.7780.8070.9680.9560.9640.9631.00用Excel或orgin作出吸光度对BSA浓度的关系曲线五、实验结果分析得到的吸光度对BSA浓度的关系曲线R2值大于0.99的时数据较好。如果R2值较小，即测得的吸光度与浓度的线性不是很好。究其原因可能有以下两点：一是移液枪的操作不是很熟练，二是移液枪在移液过程中存在着气泡，使移的液体体积不准确。注意事项：1.由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。2.Bradford法的所测的蛋白浓度和595nm吸收值的直线变化关系是有一定范围的，其实包括bradford本人也认为用二次曲线关系更合适，但在小范围内，可以当成直线关系。所以采用二次曲线关系，一般都可以使R平方达到0.99以上，吻合度是非常高的，用于计算蛋白浓度也是非常准确的。3.由于各种原因，每一次测标样的时候都会和以前的标样的结果不太一致，所以如果对蛋白浓度要求比较严格的话推荐每一次测蛋白浓度前都必须重新测标样并绘制曲线关系，而不能采用以前的曲线关系进行计算。