酶工程实验报告四(纤维素酶酶促反应初速度的测定)

1本科学生实验报告学号104120440姓名孙永升学院生命科学学院专业、班级10生物技术实验课程名称酶工程实验教师及职称李俊俊讲师开课学期2012至2013学年第二学期填报时间2013年5月8日云南师范大学教务处编印2实验名称实验方式小组成员实验四：纤维素酶酶促反应初速度的测定小组合作XXXXXXXX1、实验目的求出在一定条件下测定酶活力的初速度时间范围，并了解它的意义，了解浓度度对曲线的影响。2、实验仪器、试剂和溶液：2.1仪器：紫外分光光度计、比色皿（3个）、恒温水浴锅、试管架（1个）、l移液管、洗耳球、标签（若干）、分析天平（感量0.01mg）等。2.2试剂和溶液2.2.1柠檬酸钠缓冲液，0.05mol/L，pH4.82.2.210mg/ml的CMC-Na溶液（底物溶液）2.2.3DNS试剂（CMCA-DNS）2.2.4纤维素酶液3、实验原理或装置示意图：原理:产物生成量与时间的关系曲线称为酶反应的进程曲线。曲线的斜率就是酶反应过程中的反应速度。在一定时间内反应速度维持恒定，但随着时间的延续，反应速度逐渐降低。这是由于：底物浓度的降低，产物浓度的增加加速了逆反应进行；产物的抑制作用，产物的积累导致pH改变；酶会部分失活。因此，为了准确表示酶的反应速度就必须采用初速度维持恒定的速度。在酶活力测定时，一般应先做进程曲线，然后再求出代表初速度的反应时间范围。本实验采用最适pH、最适温度和足够高的底物浓度，来测定不同酶浓度下反应速度3的时间范围。4、实验方法步骤、操作流程及注意事项：4.1实验方法与步骤：1、酶液制备精确称取固体纤维素酶0.05g、0.1g、0.15g、0.2g，分别溶于100mL蒸馏水中，制成浓度为0.5mg/mL、1mg/mL、1.5mg/mL、2mg/mL的酶液。2、预热(1)分别取50mL的底物溶液和不同浓度的已制备好的纤维素酶酶液于250mL三角瓶中，在50℃水浴中保温10min。（2）将保温后的酶液迅速倒入保温后的底物溶液中，振荡混匀，并立即用秒表计时，在50℃水浴中继续保温。3、测定步骤（1）保温时间：3min、6min、9min、12min、15min、20min、25min、30min、40min、50min、60min。（2）保温到不同的时间时，迅速取2mL反应液于装有3mLDNS试剂的25mL试管中（取两次，每次时间间隔相同），迅速振荡均匀。（3）将两支试管沸水浴5min，自来水冷却后，加蒸馏水20mL。摇匀，在540nm处读取OD值。（4）空白管：在25mL试管中依次加入1mL底物溶液、3mLDNS、1mL对应浓度的酶溶液。（注意：每次加入溶液时均需充分混合均匀）注意：原酶液的稀释对于测定反应初速度进程曲线很关键，四种酶液稀释浓度的OD值控制在0—1之间。本实验在纤维素酶最适反应条件50℃、pH4.8下测定不同浓度下纤维素酶反应初速度值。44.2操作流程：A制备不同浓度酶液↓B预热↙↘50mL的底物溶液纤维素酶酶液于250mL三角瓶中↓C50℃水浴中保温10min↓D保温后底物与酶液反应↓E不同时间保温保温不同时间：↓F测定↙↙↘↘①反应终止→②沸水浴5min→③定容至25ml→④测定OD540吸光值↓G作酶反应进程曲线4.3实验注意事项①反应温度准确，酶液准确稀释。不同pH所用酶液用对应pH缓冲液稀释②试管上编号：贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落；③移液管使用时量取精准，保证结果可靠准确。④精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理；⑤避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时；时间时，迅速取2mL反应液于装有3mLDNS试剂的25mL试管中（取两次，每次时间间隔相同），迅速振荡均匀。流水冷却后，加蒸馏水20mL。空白管：在25mL试管中依次加入1mL底物溶液、3mLDN、1mL对应浓度的酶溶液。3min、6min、9min、12min、15min、20min、25min、30min、40min、50min、60min。迅速取2mL反应液于装有3mLDNS试剂的25mL试管中（取两次，每次时间间隔相同），迅速振荡均匀将酶液迅速倒入底物溶液振荡混匀，立即用秒表计时于50℃水浴中继续保温55、实验结果与数据处理：5.1实验数据与结果：如表一表一5.2结果处理以反应时间为横坐标，以相对反应速度（吸光度值）为纵坐标，做出四种酶浓度的进程曲线，求出各种酶浓度下的初速度时间范围和反应初速度。统计软件SPSS作图分析如图一、图二：纤维素酶反应的速度曲线OD540值时间(min)酶浓度mg/ml0.20.40.60.830.39950.26750.52600.711560.65600.34050.72901.064090.81700.54751.00101.2330120.93800.66101.13701.2730151.01200.70801.15601.2930201.09700.81551.29301.4340251.16900.90301.36201.5520301.23700.87951.42351.5620401.29400.97351.52301.6180501.35801.01351.59551.6860601.41601.05051.62451.79006图一不同纤维素酶浓度反应动力学曲线369121520253040506036912152025304050603691215202530405060369121520253040506000.20.40.60.811.21.41.61.82010203040506070时间（min）OD5400.2mg/ml0.4mg/ml0.6mg/ml0.8mg/ml图二7由图一、图二发现,同一种酶的不同浓度具有不同的斜率。所测纤维素四种酶浓度的动力学曲线虽然是非直线,但在3～25min呈线性关系。且各自线性关系不同。不同酶浓度的反应初速度时间范围和反应初速度如下表一所示。表一不同酶浓度的反应初速度时间范围和反应初速度酶浓度（mg/ml）反应初速度时间范围（min）线性关系反应初速度（v）0.23～30y=0.0279x+0.49680.02790.43～12y=0.0463x+0.10730.04630.63～12y=0.0702x+0.32200.07020.83～9y=0.0869x+0.48130.0869综合上表可得出结论：反应速度随着反应时间的延长,酶反应速度下降。这主要是因为随着反应的进行,底物浓度降低,产物浓度增加,从而加速了逆反应的进行。因此,为准确地表示酶活力,需采用初速度来表示,试验结果证明四种不同纤维素酶浓度酶促反应时间在为30min内较好[1]。6、分析与讨论：6.1分析酶促反应中反应初速度又称初速率(initialrate)，是酶促反应最初阶段的反应速度。它是衡量整个酶促反应的速度，用产物生成量与时间的关系曲线称为酶反应的进程曲线。曲线的斜率就是酶反应过程中的反应速度。此阶段特点：(1)酶反应速度保持恒定不变；(2)底物浓度没有明显减少，通常指5%的底物被利用；(3)产物浓度非常低；(4)逆反应可忽略不计。通过酶反应的进程曲线，在一定时间内反应速度维持恒定，但随着时间的延续，反应速度逐渐降低。这是由于：底物浓度的降低，产物浓度的增加加速了逆反应进行；产物的抑制作用，产物的积累导致pH改变；酶会部分失活。我们可以得到酶在各个时间范围内的反应速度，由曲线走势最为关键的是得到不同浓度下纤维素酶的反应初速度，来准8确表示酶的反应速度。6.2讨论从实验结果表一可以看出不同酶浓度的反应初速度时间范围与反应初速度差异极大，实验中用同一纤维素酶测定其不同浓度反应进程曲线，纤维素酶浓度0.2mg/ml，0.4mg/ml，0.6mg/ml，0.8mg/ml，实验中采用最适pH、最适温度和足够高的底物浓度，采用比色法求得还原糖的浓度,生成的葡萄糖的含量与所测的吸光度成正比[2]。因此随酶浓度增加曲线应该逐渐升高，0.4mg/ml测定时可能存在系统误差，如温度、酶液称取与稀释未达要求等操作失误，导致曲线最低，结果不可靠。除次，在最适条件下随纤维素酶浓度升高反应初速度时间范围呈现降低趋势，反应初速度不断升高。四种浓度纤维素酶的酶促反应时间在为30min内较线性关系极好，因此反应初速度表时间范围在30分钟内[3]。由测定结果可见，在一定的温度条件下，一定酶液用量（浓度）和酶反应时间对测定结果的影响较大，其中①酶液用量与底物浓度的影响都遵循反应动力学原理。在底物浓度较低时，酶反应速度与底物浓度的增加成正比关系；底物浓度过高时，由于高浓度底物的抑制作用，酶反应速度反而会下降。②酶解反应时间的选择。由酶反应速度曲线可见，反应速度随着反应时间的延长，酶反应速度下降。这主要是因为随着反应进行，底物浓度降低，产物浓度增加，从而加速了逆反应的进行。因此，为准确地表示酶活力，需采用初速度来表示，试验结果证明酶解时间为30min为宜。7、实验小结：①初步掌握纤维素酶酶促反应初速度的测定方法，了解酶促反应动力学曲线的意义。②由酶促反应的进程曲线获得初速度反应时间范围和酶反应速度表征初速度的动力学涵义。③测酶活时严格控制影响到的因素，如反应温度、时间、pH等。④量取固体酶液时精确，溶解稀释做到准确无误，减少实验操作误差，增加结果可信度。⑤对反应后的实验结果认真仔细观察做好记录。养成科学分析问题的习惯。改进：为使结果准确，可信尽可能减少操作人为的、系统的不必要误差做到：①在小组做实验种形成操作标准化、进程车间化，分工明确，计时精确，终止液DNS9加入迅速。②量取固体酶液、蒸馏水等精确无太大偏差，溶解稀释做到准确无误。8、实验思考题：（1）、什么是酶反应进程曲线？答：产物生成量与时间的关系曲线称为酶反应的进程曲线：纵坐标一般是生成物量或者是酶的反映速率，横坐标可以是时间，温度，PH，酶的浓度或底物浓度，曲线就是纵坐标随横坐标的变化而变化所绘制出来的，曲线的斜率就是酶反应过程中的反应速度。（2）、测定酶活力时为什么要测量反应的初速度，且常以测定产物增加量为宜?答：在一般的酶促反应体系中，底物往往是过量的，测定初速度时，底物减少量占总量的极少部分，不易准确检测，而产物则是从无到有，只要测定方法灵敏，就可准确测定。因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为合适.测初速度的原因也是这个，因为只有在初速度下，才能保证底物过量，酶被完全饱和，如果用反应中某一阶段的速度的话，很难保证底物还是过量的，因为根本就不知道这种酶的反应速度到底有多快。（3）、为什么酶活力应在进程曲线的初速度时间范围内进行？答：要进行酶活力测定，首先要确定酶反应时间，酶的反应时间并不是任意规定的，应该在初速度时间范围内选择。可以通过进程曲线的制作而求出酶的初速度时间范围。进程曲线是在酶反应的最适条件下采用每隔一定时间测产物生成量的方法，以酶反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。从进程曲线可知，在曲线起始一段时间内为直线，其斜率代表初速度。随反应时间延长，曲线趋于平坦，斜率变小，说明酶的反应速度下降。反应速度随反应时间的延长而降低这一现象可能是由于底物浓度的降低和产物浓度的增高致使逆反应加强等原因所致。因此，要真实反映出酶活力大小，就应在初速度时间内测定。求出酶反应初速度的时间范围是酶动力学性质的一系列研究中的组成部分和必要前提。（4）、在酶活力测定中，如何保证测定的是酶反应初速度？答：①.底物过量：必须要保证要足够的底物，使酶能完全发挥其催化功能。10②.保证对于酶是饱和的，此时酶反应是一级反应，反应速度不会随着底物量而变化，测得就是初速度。③.时间的控制：根据酶促反应曲线可以看出，最开始曲线斜率比较大，然后趋于平缓（这种原因可能是生成的产物促进逆反应或是酶失活），由此，如果测定的时间选择不当的话，测的速度也不是初速度，所以在测定的时间必须掌握在曲线斜率比较大的那段时间内。除这些之外，需给酶提供最适温度、最适PH，保证没有抑制剂存在。9、参