肝微粒体的提取及其含量测定

人肝微粒体的提取及其含量测定第一部分：人肝微粒体的提取一、仪器及试剂：仪器：内切式匀浆机，高速离心机，超速离心机，表面皿数个，冰袋数个，碎冰，装碎冰烧杯，匀浆用玻璃管，不锈钢剪刀试剂：含0.15MKCl的100mM磷酸钾缓冲液（PH＝7.4）,100mM磷酸钾缓冲液材料：8号人肝（称取重量29.95g）二、实验流程：组织（记录死亡时间、储运条件）37度水浴解冻含0.15MKCl的100mM磷酸钾缓冲液（pH7.4）漂洗，除去表面血迹及组织液（缓冲液事先已置于冰箱中冷藏）将组织置于下垫冰块的表面皿中，用剪刀手动剪碎内切式均浆机匀浆（过程中注意将组织置于冰块包围住，保持低温环境）9000×g离心20min，取上清，即得S9超速离心机105,000×g超速离心60min取沉淀（过程中防止上清表面的油膜粘附到沉淀表面，应用吸管将油膜慢慢吸出，而不能倾倒）重悬于100mM磷酸钾缓冲液（pH7.4）中（重悬过程中应注意不要产生气泡）105,000×g超速离心60min取沉淀，用100mM磷酸钾缓冲液（pH7.4）重悬得微粒体（此次重悬时应使用尽量少的缓冲盐体积，以防止微粒体浓度被过于稀释，重悬过程同样注意油膜与气泡）磷酸盐缓冲液中，分装塑料小管中，-80°C贮存三、实验结果：一共称取8号人肝组织29.95g，提取出肝微粒体23mL，经蛋白含量测定，微粒体二次重悬液蛋白含量以牛血清白蛋白计为37.4mg/mL，加入100mM磷酸盐缓冲液（pH=7.4）稀释至86mL，得10mg/mL的微粒体储备液，分装保存于-80度待用。第二部分微粒体中蛋白含量测定一、仪器和材料：0.1NNaOH(2gNaOH溶于500mL水),1%酒石酸钾（1.342g四水合酒石酸钾溶于100mL水），2%无水碳酸钠（溶剂为0.1NNaOH），0.5%硫酸酮（溶剂为1%酒石酸钾），甲液（2%无水碳酸钠50ml，加0.5%硫酸酮1ml，混匀，临用时现配），牛血清蛋白标准液500μg/ml(溶剂为0.1NNaOH)Folin酚(福林试剂)试剂：1份Folin酚原液用蒸馏水稀释3倍得工作液，Folin酚试剂原液配制方法如下：1000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)50g钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)12.5g蒸馏水350mL85%磷酸25mL浓盐酸50mL文火回流10h。取去冷凝器,加入硫酸锂(Li2SO4)25g蒸馏水50mL混匀,加入几滴液体溴,再煮沸15min,以驱逐残溴及除去颜色,溶液应呈黄色而非绿色。若溶液仍有绿色,需要再加几滴溴液,再煮沸除去之。冷却后,定容至500mL,混合均匀过滤。试剂呈金黄色贮于棕色试剂瓶内。二、实验方法：1、测定原理：利用Folin酚试剂与蛋白质的酪氨酸与色氨酸残基反应在680nm处产生吸收2、实验过程：1）样品测定：试剂母液浓度体系浓度加入体积H2O－－1mLHLM－－10μL/5μL甲液－－3mL混匀，放置10minFolin酚试剂－－0.8mL混匀，50oC水浴10min或者室温30min冷水中终止反应另制备空白一份，不加HLM，按照样品操作程序制作即得2）标准曲线：试剂母液浓度体系浓度加入体积H2O－－(1.00-X)mLBSA500μg/mL－XmL甲液－－3mL混匀，放置10minFolin酚试剂－－0.8mL混匀，50oC水浴10min或者室温30min冷水中终止反应X代表各浓度的标准样品加入的BSA体积，从小至大分别为0.1,0.2,0.3,0.4,0.5,0.63）样品检测：反应完成后，置于680nm处用分光光度计测量吸光度值。三、实验结果：1）标准曲线：Level加入BSA母液体积mL蛋白量ug吸光度值B000.07870.080500.082310.1500.28230.28390.20340.285520.21000.43610.435050.354550.43430.31500.59930.58570.50520.572140.42000.7430.752050.671550.761150.52500.85380.86710.78660.880460.63000.95390.99930.91881.0447Figure1BSA标准曲线2）样品测定：样品编号加入微粒体uL吸光度值蛋白量ug蛋白含量mg/mLSa1101.09131.11711.0366335.41684833.5416848Sa1101.1429Sa250.66880.68920.6087187.24363637.4487272Sa250.7096B00.07870.0805000B00.0823四、备注：本实验准备试剂时，要注意一些水合物的称量值，应按照其不含水的量计算微粒体二次重悬液的蛋白含量为37.4mg/mL，共23mL，将其稀释至86mL，得到10mg/mL的微粒体储备液，分装后置零下80度冰箱冷冻保存待用。y=346.28x-23.537R2=0.9972-500501001502002503000.10.30.50.70.91.1SpectrumAbsorbtionproteinamount第三部分人肝微粒体中的P450含量测定一、实验材料：仪器：双光束紫外分光光度计，比色杯材料：100mM磷酸盐缓冲液（pH=7.4），连二亚硫酸钠（固体），CO二、实验方法：1、实验过程：微粒体悬液0.1M磷酸缓冲液（PH7.4）中稀释至0.5mgpro/ml。各取3ml，加入两比色杯中(双光束)紫外分光光度计500-400nm扫描，划基线各杯中加入连二亚硫酸钠2mg或连二亚硫酸钠溶液(0.1g/ml)20μl。迅速向测定管内充CO30-60秒，充的速度要慢，防止起泡沫。稳定5min再次500-400nm扫描得到还原型细胞色素P450在450nm与490nm处的OD（吸收）值2、结果计算1000*)/(5.0)/(91nm490450Aprnmol/mg450mLmgnmolmLP－△＝三、实验结果：1）实验数据样品450nm490nm△AP450含量（nmol/mgpr）10.14020.120340.019860.43648351620.13580.116360.019440.4272527472）相关图谱：Figure2BaselineFigure3P450酶紫外吸收图3）原始数据及说明：原始数据存于大连化物所1806组紫外分光光度仪工作站电脑，E:\何芋岐文件夹中。其中beforeCO代表通入CO前扫描的基线，afterCO表示通入CO后扫描的基线；带有后缀“a”的表示连二亚硫酸钠以固体形式加入，不带“a”的表示以溶液形式加入的；-1，-2代表重复测定的序号。0.090.160.10.120.14400500420440460480AbsWavelength[nm]0.0050.0310.010.02400500420440460480AbsWavelength[nm]