牛奶中酪蛋白含量的测定

牛奶中酪蛋白的提取及含量测定一、实验原理1、牛乳的主要成分：碳水化合物（5%）、脂类（4%）、蛋白质（3.5%）、维生素、微量元素（Ca、P等矿物质）、水（87%）牛奶中的糖主要是乳糖。乳糖是一种二糖，它由D-半乳糖分子和D-葡萄糖分子通过β-1,4-糖苷键连接而成。乳糖溶于水，不溶于乙醇，当乙醇混入乳糖水溶液中时，乳糖会结晶出来，从而达到分离的目的。牛奶中的蛋白质主要是酪蛋白和乳清蛋白两种，其中酪蛋白占了牛乳蛋白质的80%。酪蛋白是白色、无味的物质，不溶于水、乙醇等有机溶剂，但溶于碱溶液。而乳清蛋白水合能力强，分散性强，在牛乳中呈高分子状态。2、等电点沉淀法：在等电点时，蛋白质分子以两性离子形式存在，其分子净电荷为零(即正负电荷相等)，此时蛋白质分子颗粒在溶液中因没有相同电荷的相互排斥，分子相互之间的作用力减弱，其颗粒极易碰撞、凝聚而产生沉淀，所以蛋白质在等电点时，其溶解度最小，最易形成沉淀物。酪蛋白的等电点为4.7左右（不同结构的酪蛋白等电点有所不同），本实验中将牛乳的pH调值4.7时，酪蛋白就沉淀出来。市售牛奶通常会添加耐酸碱稳定剂来增加粘稠度，以致即使pH调至等电点酪蛋白也沉淀的很少，故实验时可将pH稍微调过多一点再调回等电点。同时，市售牛奶由于生产过程通常导致酪蛋白组分发生变化，因而使pI偏离了4.7，通常偏酸。3、酪蛋白的提纯根据乳糖、乳清蛋白等和酪蛋白的溶解性质差异，可以用纯水洗涤来除去乳糖、乳清蛋白等溶于水的杂质，再用乙醇除去脂类，然后过渡到用乙醚洗涤，由于乙醚很快挥发，最终得到纯粹的酪蛋白结晶。4、蛋白质含量的测定（考马斯亮蓝结合法）考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区结合，这种结合具有高敏感性。考马斯亮蓝G520的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm。当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色，其最大吸收峰变为595nm。在一定范围内，考马斯亮蓝G520-蛋白质复合物呈色后，在595nm下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可以测定蛋白质浓度。二、实验器材与试剂1、器材：恒温水浴锅、离心机、抽滤装置、蒸发皿、精密pH试纸、旋涡混合器、紫外分光光度计、试管*9、5mL吸管、50mL容量瓶、100mL量筒、电子分析天平2、试剂：鲜牛奶、pH4.7醋酸-醋酸钠缓冲溶液、乙醇-乙醚混合液（95%乙醇、无水乙醚体积比1：1）、0.9%NaCl溶液、标准蛋白液（0.1mg/mL牛血清蛋白）、考马斯亮蓝G520染液三、实验操作记录1、酪蛋白的制备将20mL牛奶盛于100mL的烧杯中加热到40℃，在搅拌下慢慢加入预热至40℃、pH4.7的醋酸缓冲溶液20mL。用冰醋酸调节溶液pH至4.7，此时即有大量的酪蛋白沉淀析出。将上述悬浮液冷却至室温，离心5min（4000r/min），弃去上清液，沉淀即为酪蛋白粗品。用蒸馏水洗涤沉淀3次（每次约20mL），离心5min（3000r/min），弃去上清液。在沉淀中加入约20mL95%乙醇，搅拌片刻，将全部的悬浊液转移到布氏漏斗中抽滤，用乙醇-乙醚混合溶液洗涤沉淀2次，最后用乙醚洗涤沉淀2次，抽干。将沉淀摊开在培养皿中，风干，保存至下周。2、标准曲线的制作取7支干净干燥试管，按下表进行编号并加入试剂。混匀，室温静置3min，以第一管为空白，于波长595nm处比色，读取吸光度，以吸光度为纵坐标，各标准液浓度为横坐标得标准曲线。表1标准曲线的制作试剂\编号1（空白）234567标准蛋白液/mL——0.10.20.30.40.60.80.9%NaCl/mL1.00.90.80.70.60.40.2考马斯亮蓝染液/mL4.04.04.04.04.04.04.0蛋白质浓度/(μg/mL)0102030406080𝐴595𝑛𝑚0.0000.1510.2600.3260.4400.5350.6363、样液的测定准确称取25mg自制酪蛋白，置于50mL烧杯中，加入约20mL0.9%NaCl，再准确加入1mol/LNaOH5mL，当酪蛋白溶解后，准确加入1mol/L乙酸5mL，充分振摇直至酪蛋白完全溶解为止（不溶可在50℃水浴加热至溶），全部转移至50mL容量瓶中，加0.9%NaCl稀释定容至50mL，充分摇匀。取5mL上述蛋白液，转移至另一个50mL容量瓶中，用0.9%NaCl稀释定容至50mL。另取一支干净试管，加入样品液1.0mL及考马斯亮蓝染液4.0mL，混匀，室温静置3min，于波长595nm处比色，读取吸光度，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。四、实验结果1、酪蛋白产量及产率计算表2酪蛋白产量及产率计算酪蛋白质量/g牛奶样品质量/g产率/g0.7820.033.89%2、标准曲线由散点图可以看出，后两个点与前面几个点的线性关系并不好，出现了明显的负偏差。故在线性拟合时舍去后两个点，取前5个点进行拟合。拟合出的直线R²达到0.983，线性较好。2、样品液的吸光度是0.324，对照标准曲线得酪蛋白浓度为28.40μg/mL。称取的酪蛋白样品质量为0.0267g，稀释倍数为500倍。ω(酪蛋白)=酪蛋白浓度×1.0𝑚𝐿×500样品质量×100%=28.40×10−6×1×5000.0267×100%=53.2%五、误差分析与讨论1、本次制备实验中得到的蛋白质量较多，但纯度较低，分析原因如下：1）得到的蛋白质略呈黄色，且有些发粘，说明可能脱脂不彻底，蛋白质产品中含有脂质。2）考马斯亮蓝G520染液中有沉淀，最后影响考马斯亮蓝-蛋白质复合物溶液的吸光度。3）配制标准溶液时操作上可能有误差，如往试管中加入溶液时挂在管壁，且最终也没有与下方溶液混合均匀，导致标准溶液的浓度可能不准，致使标准曲线不准，数据处理时也发现数据线性并不好，尤其是浓度较大时，虽然可能是超出考马斯蓝线性范围，但不能排除操作失误的可能。2、注意事项1）试管提前一周清洗干净并晾干，否则制作标准曲线时无法保证各管浓度。并且不干净的试管在加溶液时容易挂管壁，不利于控制标准蛋白液浓度。2）在配制不同浓度标准蛋白液时，各组分的体积要准确移取，特别是量较少的标准蛋白液，只要稍微洒出一点就会导致较大的相对误差3）蛋白质粗品的洗涤一定要按照规范做，每一次离心洗涤时要将搅匀，在布氏漏斗上洗涤时要先微接抽气管，待洗出液缓慢流出后，再接紧橡皮管抽干。y=0.01055x+0.02440R²=0.9831400.10.20.30.40.50.60.70.80.91020406080100A595nm蛋白质浓度（μg/mL）标准曲线