随机引物与oligodT-区别

1.Oligo(dT)capture因为Oligo(dT)与mRNA的Poly(A)尾巴可以发生特异性结合，所以用Oligo(dT)特异结合到mRNA上Poly(A)尾端，以此可以特异地将mRNA从总RNA中分离出来。属于亲和层析技术。2.反转录（RT-PCR）因绝大多数真核细胞mRNA3’端具有Poly(A)尾，Oligo(dT)与其配对，仅mRNA可被反转录。由于Poly(A)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物所得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。但是在反转录从mRNA获得cDNA时，也可以用随机六聚体引物和特异性引物。随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时，可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，若PCR反应用二种特异性引物，第一条链的合成可由与mRNA3’端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。使用oligodT引物扩增的产物,可以保证扩增产物包括mRNA的3'末端(减少rRNA的干扰),但是oligodTprimer扩增有一个问题,就是扩增片段的长度和扩增产物所包含的信息量的问题,之所以有长度这个问题,一方面和lz所提到的RNA完整性有关,但最重要的限制在于逆转录酶的延伸能力.用oligodTprimer扩增可能出现扩增出来的片段长度短,虽然都有mRNA的3'端,但是序列信息多位于3'-UTR附近,若扩增序列太短,则有用信息很少,不利于序列的识别和分析.使用randomprimer,也有片段长度的限制,但是由于它的逆转录并不一定在mRNA的末端起始,而是在随机位置起始,所以它的扩增片段带有更多CDS的信息.但是如果是用总RNA逆转录的话,有可能会受到rRNA的干扰.至于Gsp,只是在扩增已知gene/genefamily以及部分原理的RACE中使用.用随机引物时要去除总RNA中的tRNArRNA,只保留mRNA如果接下来你的PCR产物是外显子，就用oligodT;如果是内含子或者包括部分内含子，就用randommRNA反转录之后的cDNA为模板进行PCR，不都是外显子吗？内含子在这之前都被剪切掉了。所以不知道“内含子...”这句话是什么意思，或者有其他的含义，求解！如果你想要做蛋白表达，就用OligodT，要是你做的基因包括内含子就用随机引物喽。我最近在用逆转cDNA为模板扩增CDS序列（3000bp左右），同时用oligodT和random引物逆转，结果大多数时候两者扩增效果是一样的，少部分情况只有random能扩出目的带，尤其是中间段和靠近5‘端的CDS区——这结果基本和网上很多资料相吻合——比如随机引物更适合CDS长的、有二级结构的基因。显然是选randomprimer更好，其实说明书是有写的啦，原因是RT-PCR逆转录是要得到一个所有的RNA的cDNA库，然后再P出你要的“几个基因”，所以不是每个基因的mRNA都是有polyA的，很多都是没有的，microRNA，piRNA，很多都没有哦，所以如果你用oligodT引物，就自然会miss掉很多（确实是很多）的RNA，而随机引物不会有这个问题，用它反转录出来的cDNA丰度更高，结果更加准确看你的目的基因的mRNA有没有polyA尾巴有的话就用oligodT没有的话就用随机引物一般在反转录的时候除了引用特异性引物和oligodT作为反转录得到第一条cDNA链外，运用随机引物的效果也很好，随机引物一般有6-10碱基的寡核苷酸引物，引物的序列是随机的，也就是说随机引物是各种引物的混合物，随机序列的肯能性很多，由于随机引物可能在一条mRNA链上有多个结合位点而从多个位点同时发生反转录，比较容易合成特长的CDNA；现在随机引物已经商品化，没有必要自己合成，直接购买就可以，Takara公司就有，我用的挺好的，有两种：pd(N)6-含有6个碱基的随机序列；pd(N)9-含有9个碱基的随机序列，我用的是pd(N)6。