从全血和体液中提取基因组DNA的操作步骤(精)

1从全血和体液中提取基因组DNA的操作步骤提取DNA需要的仪器和试剂：⑴1.5ml离心管⑵移液管:1000ul,200ul,40ul各一支和移液管尖头:100-1000ul,1-200ul各一盒⑶微型滤柱（备用）⑷小型旋转混合器一台⑸小型离心机:可放入1.5ml离心管和2ml收集管.⑹恒温水浴⑺电冰箱:-20C,4C⑻无水乙醇(自备)⑼70%乙醇(自备)⑽利普生DNA提取试剂盒。内含:⑴裂解液1⑵裂解液2⑶消化液⑷纯化液⑸弥散液⑹蛋白酶K⑺带钩细玻棒一盒⑻微型滤柱若干。提取DNA前注意：⑴使血样品内容物达到室温（15–25C）。⑵预热水浴到58C，为步骤3作准备。⑶置弥散液于58C内，为步骤4或步骤7作准备。⑷所有的离心步骤均在室温下进行。⑸lml全血可提得15-60ugDNA。一．从1ml全血或体液中提取DNA的步骤：⑴裂解1：取1ml全血，血桨，血清，淋巴细胞放入到1.5ml的离心管中，加入400ul裂解液1。上下翻转，使沉淀物分散，旋转脉动15秒后放入离心机中离心，离心速率为8000rpm，1min.。倒掉上层液，可见离心管底部有血色沉淀。重复此裂解步骤一次，这次是加入1ml裂解液1。最后用移液管吸净所有上层液弃去,以使离心管底部的血色沉淀不再残留有裂解液1。⑵裂解2:在上面离心管中加入1ml裂解液2。上下翻转，务必使沉淀物分散，旋转脉动15秒后放入离心机中离心，8000rpm，1min.。倒掉上清液，可见离心管底部有微量淡红色沉淀。重复此裂解步骤一次，这次仍然是加入1ml裂解液2，最后用移液管吸净所有上清液弃去，以使离心管底部的灰白色沉淀不再残留有裂解液2。⑶消化：吸取蛋白酶K10ul(=0.2mg)加入到上面的离心管中，用移液管尖头反复吹打，使蛋白酶K与沉淀物均匀接触后，加入320ul消化液，上下翻转离心管，务必使沉淀物分散于消化液中。放入58C水浴中消化15分钟。最后可见澄明的消化液体。⑷纯化：在上面的消化液体中加入110ul纯化液，上下翻转离心管几下后，离心，速率为15000rpm,1min，把上清液吸出放入到装有1000ul无水乙醇的1.5ml离心管中，轻轻上下翻转10次，可见絮状DNA析出。用带钩的玻璃棒挑起絮状DNA放入到100ul70%乙醇中耒回漂洗20次，钩出DNA，在空气中凉干一下后放入到100ul弥散液中。把DNA弥散液保存于4C，过夜，使之充分弥散后使用。提取完毕。如要立即用此DNA做PCR实验，把DNA弥散液放在58C水浴中，保温30分钟,用手指拍打离心管子，使DNA弥散后使用。提取完毕oooooooo2⑸收集：(在DNA极少量，不能用带钩玻璃棒挑起的情况下)把有絮状DNA的溶液倒入微型柱过滤器(包括滤柱和收集管)中，滤器放入离心机内，离心:8000rpm,1min..DNA便附着在滤漠上，弃去滤液，把滤柱放回收集管上。⑹吸取200ul70%乙醇于滤柱内，离心8000rpm，1min，弃去滤液。把滤柱放回收集管上，再离心15000rpm，1min..使吸附在滤膜上的DNA不再附有乙醇。⑺回收DNA:把上面附着DNA的滤柱放入一个干净的1.5ml离心管中。吸取100ul已温热到58C的弥散液，轻轻放入滤膜的表面，保温58C静置10分钟。离心8000rpm，1min.，DNA弥散液便滤入到干净的1.5ml离心管内。此DNA弥散液可即时作PCR实验用。提取完毕。附：如从2ml全血中提出取DNA，方法和步骤与从1ml全血一样，只是在步骤⑷纯化之前，把两个1ml全血的消化液管内容物合并后，加入220ul纯化液，上下翻转离心管几下后，离心，速率为15000rpm,1min，把上清液吸出放入到装有1800ul无水乙醇的2ml管中，轻轻上下翻转10次，可见絮状DNA析出。用带钩的玻璃棒挑起絮状DNA放入到200ul70%乙醇中耒回漂洗20次，钩出DNA，在空气中凉干一下后放入到100ul弥散液中。把DNA弥散液保存于4C，过夜，使之充分弥散后使用。提取完毕。如要立即用此DNA做PCR实验，把DNA弥散液放在58C水浴中，保温30分钟,用手指拍打离心管子，使DNA弥散后使用。提取完毕二．从200ul全血或体液中提取基因组DNA的操作步骤⑴裂解1：取200ul全血，血桨，血清或淋巴细胞放入到1.5ml的离心管中，加入200ul的裂解液1。上下翻转，使沉淀物分散，旋转脉动15秒后放入离心机中离心，离心速率为14000rpm，1min.。倒掉上层液，可见离心管底部有微量沉淀。重复此裂解步骤一次，这次也是加200ul裂解液1。最后用移液管吸净所有上清液弃去,以使离心管底部的沉淀不再残留有裂解液1。⑵裂解2:在上面离心管中加入200ul的裂解液2。上下翻转，务必使沉淀物分散，旋转脉动15秒后放入离心机中离心，14000rpm，1min.。倒掉上清液，重复此裂解步骤一次，这次仍然是加入200ul裂解液2，最后用移液管吸净所有上清液弃去，以使离心管底部的沉淀不再残留有裂解液2。⑶消化：吸取蛋白酶K5ul(=0.1mg)加入到上面的离心管中，用移液管尖头反复吹打，使蛋白酶K与沉淀物均匀接触后，加入85ul消化液，上下翻转离心管，务必使沉淀物分散于消化液中。放入到58C水浴中消化15分钟。最后可见澄明的消化液体。⑷纯化：在上面的消化液体中加入30ul纯化液，上下翻转离心管几下后，离心，速率为14000rpm,1min，把上清液吸出放入到装有240ul无水乙醇的1.5ml离心管中，轻轻上下翻转10次，可见溶液稍有混浊就是絮状DNA析出。⑸收集：把有絮状DNA的溶液倒入微型柱过滤器(包括滤柱和收集管)中，滤器放入离心机内离心，离心速率8000rpm,1min..DNA便附着在滤漠上，弃去滤液，把柱滤器放回收集管上。⑹吸取50ul70%乙醇于滤柱内，离心800rpm，1min，弃去滤液。把滤柱放回收集管上，再离心15000rpm，1min..使吸附在滤膜上的DNA不再附有乙醇。⑺回收DNA:把上面附着DNA的滤柱放入一个干净的1.5ml离心管中。吸取ooooooo350ul已温热到58C的弥散液，轻轻放入滤膜的表面，滤器在水浴58C保温10分钟。离心8000rpm，1min.，DNA弥散液便滤入到干净的1.5ml离心管内。此DNA弥散液可即时作PCR实验用。提取完毕。附：从100ul全血或体液中提取基因组DNA⑴裂解1：取100ul全血，血桨，血清或淋巴细胞放入到1.5ml的离心管中，加入100ul的裂解液1。上下翻转，使沉淀物分散，旋转脉动15秒后放入离心机中离心，离心速率为14000rpm，1min.。倒掉上层液，可见离心管底部有微量沉淀。重复此裂解步骤一次，这次也是加100ul裂解液1。最后用移液管吸净所有上清液弃去,以使离心管底部的沉淀不再残留有裂解液1。⑵裂解2:在上面离心管中加入100ul的裂解液2。上下翻转，务必使沉淀物分散，旋转脉动15秒后放入离心机中离心，14000rpm，1min.。倒掉上清液，重复此裂解步骤一次，这次仍然是加入100ul裂解液2，最后用移液管吸净所有上清液弃去，以使离心管底部的沉淀不再残留有裂解液2。⑶消化：吸取蛋白酶K5ul(=0.1mg)加入到上面的离心管中，用移液管尖头反复吹打，使蛋白酶K与沉淀物均匀接触后，加入60ul消化液，上下翻转离心管，务必使沉淀物分散于消化液中。放入到58C水浴中消化15分钟。最后可见澄明的消化液体。⑷纯化：在上面的消化液体中加入20ul纯化液，上下翻转离心管几下后，离心，速率为14000rpm,1min，把上清液吸出放入到装有160ul无水乙醇的1.5ml离心管中，轻轻上下翻转10次，可见溶液稍有混浊就是絮状DNA析出。⑸收集：把有絮状DNA的溶液倒入微型柱过滤器(包括滤柱和收集管)中，滤器放入离心机内离心，离心速率8000rpm,1min..DNA便附着在滤漠上，弃去滤液，把柱滤器放回收集管上。⑹吸取50ul70%乙醇于滤柱内，离心800rpm，1min，弃去滤液。把滤柱放回收集管上，再离心15000rpm，1min..使吸附在滤膜上的DNA不再附有乙醇。⑺回收DNA:把上面附着DNA的滤柱放入一个干净的1.5ml离心管中。吸取50ul已温热到58C的弥散液，轻轻放入滤膜的表面，滤器在水浴58C保温10分钟。离心8000rpm，1min.，DNA弥散液便滤入到干净的1.5ml离心管内。此DNA弥散液可即时作PCR实验用。提取完毕。三．从10ml全血中提取基因组DNA的操作步骤设备要求：离心机能放入50ml的离心管。由于离心速率低，因而离心时间长一些。⑴裂解1：取10ml抗凝的全血放入到50ml的离心管中，加入10ml裂解液1。上下翻转，使沉淀物分散，在振摇机中振摇10分钟,放入离心机中离心,离心速率为2200rpm,10min..可见离心管底部有血色沉淀.倒掉上层液，重复此裂解步骤一次，这次仍然是加入10ml裂解液1。最后用移液管吸净所有上清液弃去,以使离心管底部的血色沉淀不再残留有裂解液1。⑵裂解2:在上面离心管中加入10ml裂解液2。在振摇机中振摇10分钟,务必使沉淀物分散,放入离心机中离心,离心速率为2200rpm,10min..可见离心管底部有少量灰色沉淀.倒掉上层液,留下沉淀.。重复此提取步骤一次，这次仍然是加入10ml裂解液2。最后用移液管吸净所有上清液弃去,以使离心管底部的灰白色沉淀不再残留有裂解液2。⑶消化：吸取蛋白酶K100ul(=2mg)加入到上面的离心管中，用移液管尖头ooooo4反复吹打，使蛋白酶K与沉淀物均匀接触后，加入1.6ml消化液，振摇3分钟,放入58C水浴中消化1小时。消化其间，要取出离心管用手拍打一下，帮助内容物均匀消化。最后可见澄明的消化液体。⑷纯化：在上面的消化液体中加入600ul纯化液，混匀后，离心，速率为2800rpm,15min，把上清液吸出放入到装有5ml无水乙醇的带盖的管中，轻轻上下翻转10次，可见絮状DNA析出。用带钩的玻璃棒挑起絮状DNA放入到1000ul的70%乙醇中耒回漂洗20次，钩出DNA，在空气中凉干一下后放入到500ul弥散液中。把DNA弥散液保存于4C，过夜，使之充分弥散。提取完毕。如要立即用此DNA做PCR实验，把DNA弥散液放在58C水浴中，保温30分钟,用手指拍打离心管子，使DNA弥散后使用。提取完毕。附：如从5ml全血中提取DNA，只需按比例减少各步骤的试剂用量。四．从口腔两颊刮物提取DNA的操作步骤DNA的浓度一般是3-23ug/ml,OD值为1.7-1.9。⑴裂解1:吸取600ulPBS到1.5ml离心管中,剪入刮颊刷.旋转脉动15秒.加入400ul裂解液1.旋转脉动15秒后放入离心机中离心,8000rpm,1min..倒掉上层液。重复此提取步骤一次，这次是加入1000ul裂解液1。最后用移液管吸净所有上清液弃去,以使离心管底部的沉淀不再残留有裂解液1。⑵裂解2:在上面离心管中加入1000ul裂解液2.旋转脉动15次后放入离心机中离心,8000rpm,1min..可见离心管底部有微量沉淀.倒掉上层清液。重复此裂解步骤一次，这次仍是加入1000ul裂解液2。最后用移液管吸净所有上清液弃去,以使离心管底部的沉淀不再残留有裂解液2。刮刷留在离心管内。⑶消化:吸取20ul蛋白酶液(=0.4mg)加入到上面的离心管中,旋转脉动一下,再加入160ul消化液,又旋转脉动一下后,放入58C水浴中消化15分钟.取出后可见澄清的消化液。离心8000rpm,20秒，把盖上的液滴回落到管中.然后轻轻取出刮刷去掉.⑷纯化:加入60ul纯化液到上面离心管中，旋转脉动一下,放入离心机中离心，15000rpm,1min。把上清液吸出放入到240ul无水乙醇中轻轻上下翻转10次,可见云状DNA析出,并浮于液面..⑸收集:把上液倒入微型过滤器中,滤器放入离心机内离心:8000rpm,1min..DNA便附着在滤漠上.弃去收集管中的滤液。⑹吸取50ul70%.乙醇于滤柱内.离心8000rpm,1min.弃去