DIG-High-Prime-DNA标记及杂交检测试剂盒I

1DIGHighPrimeDNALabelingandDetectionStarterKitIDIGHighPrimeDNA标记及杂交检测试剂盒I说明书版本：Version11（2010年8月）利用随机引物法及DIG-dUTP（碱不稳定）进行DNA标记反应，采用酶联免疫方法及发色底物NBT/BCIP进行杂交分子的显色。本试剂盒可对10ng-3μgDNA进行12次标记反应，可进行24次杂交检测反应（100cm2杂交膜）。产品目录号：11745832910试剂盒于-15~-25℃保存21.概况1.1说明书内容1.概况………………………………………………………………………………………21.1说明书内容…………………………………………………………………………………21.2试剂盒组成…………………………………………………………………………………32.介绍………………………………………………………………………………………42.1产品概述…………………………………………………………………………………43.实验步骤和需要的材料…………………………………………………………………73.1实验开始前准备…………………………………………………………………………73.2DIG-DNA标记……………………………………………………………………………73.3定量标记反应效率………………………………………………………………………103.4DNA转膜和固定…………………………………………………………………………123.5杂交………………………………………………………………………………………133.6免疫检测…………………………………………………………………………………143.7探针洗脱和重探…………………………………………………………………………164.结果………………………………………………………………………………………174.1典型结果…………………………………………………………………………………175附录………………………………………………………………………………………185.1疑难问题解决……………………………………………………………………………185.2参考文献…………………………………………………………………………………1831.2试剂盒组成管/瓶号标签成分及功能1DIG-HighPrime•50μl，用于DNA的随机引物法高效标记，即用•5×标记反应液，含浓度优化的随机引物、核苷酸、DIG-dUTP（碱不稳定）、Klenow酶及缓冲液。•澄清的粘性溶液2DIG-labeledControlDNA•20μl，用于确定反应标记效率•pBR328DNA(5μg/ml,BamHI线性化处理)•澄清溶液3DNADilutionBuffer•3×1ml•10mMTris-HCl,1mMEDTA（含50μg/ml鱼精，pH8.0,25℃)•澄清溶液4Anti-Digoxigenin-APConjugate•100μl•750U/ml，Fab片段，羊源，结合了碱性磷酸酶•澄清溶液5NBT/BCIP•6×1ml,碱性磷酸酶显色底物•50×储液[18.75mg/mlNBT，9.4mg/mlBCIP，67%（v/v）DMSO]•澄清溶液，颜色呈黄色或棕色6Blockingsolution•4×100ml•10×储液•黄色，粘性溶液7DIGEasyHybGranules•可制备成4×100ml溶液，见P13•杂交液杂交反应所需的仪器和其他反应试剂请根据您的实验操作流程准备杂交反应所需的仪器和其他试剂，参见下表：（本说明书）杂交操作步骤设备试剂3.2DIG-DNA标记水浴设备•水，PCR级别•0.2MEDTA（pH8.0)，灭菌3.3定量标记反应效率带正电荷的尼龙膜*•DIGWashandBlockBufferSet*•TE缓冲液或•洗涤缓冲液•马来酸缓冲液•检测缓冲液•TE缓冲液43.4DNA转膜和固定紫外交联设备•2×SSC或•10×SSC3.5杂交•带正电荷的尼龙膜*•杂交袋*或•耐热的封闭塑料袋或杂交滚筒瓶注意：使用DIGEasyHyb作为杂交缓冲液时，不可用开口托盘3.6免疫检测•与杂交膜大小相适的容器•杂交袋*•DIGWashandBlockBufferSet*•TE缓冲液或•洗涤缓冲液•马来酸缓冲液•检测缓冲液•TE缓冲液3.7探针洗脱和重探•大托盘•水浴设备•10×SSC•10%SDS•0.2MNaOH带*的试剂为罗氏应用科学部提供的试剂。2.介绍2.1产品概述反应原理DIGHighPrimeDNA标记检测试剂盒（I）采用地高辛（DIG，一种甾类半抗原）进行DNA标记，所获得的探针用于后续的杂交反应，带有地高辛分子的杂交子通过酶联免疫反应进行显色检测。步骤描述DNA标记利用随机引物法和地高辛标记的核苷酸对DNA进行标记，获得探针。DIG-HighPrime为优化的5×预混反应液，包含地高辛标记的核苷酸DIG-dUTP（碱不稳定），随机引物及标记级别的酶等。杂交采用标准反应方法，DIG标记探针可以与固定在膜上的核酸进行杂交。碱不稳定的DIG-11-dUTP标记形式，可使杂交子中的DIG更加容易和有效地被洗脱，固定在膜上的核酸可以与其他DIG标记探针再次杂交。免疫检测杂交子中的DIG通过anti-DIG-AP抗体进行免疫检测，并通过发色底物NBT/BCIP进行结果显色。5应用DIG标记的DNA探针可用于：•所有形式的膜杂交反应•（微生物，人类，植物等）基因组DNA中的单拷贝基因检测样本•大小在100bp以上的DNA片段•线性化质粒，粘粒或λDNA•超螺旋DNA分析时间步骤反应时间DNA标记1h-过夜反应杂交6h-过夜反应免疫检测1.5h结果显色0.5-16h试剂盒反应次数本试剂盒包含•对10ng-3μgDNA进行12次标记反应•24次杂交检测反应（100cm2杂交膜）质量控制对DNA对照品（pBR328，未标记）进行标准标记反应，将0.1pg同源DNA点膜后进行斑点杂交，显色16h呈阳性检测结果（1pg同源DNA的杂交反应显色1h后呈阳性检测结果）。试剂盒保存/稳定性未开启的试剂盒可在-15~-25℃下稳定保存至产品有效期限，具体日期请见试剂标签说明。试剂盒需在干冰条件下运输。试剂盒开启后，不同的试剂盒组分请在下表所列的条件下保存：试剂盒组分保存Anti-Digoxigenin-APConjugate（管号4）2~8℃，可稳定保存NBT/BCIP（管号5）•2~8℃，可稳定保存6•15~25℃条件下可稳定保存1月注意：在干冰运输过程中，本试剂可能产生沉淀物质，请将试剂在37℃条件下温育以溶解沉淀物。Blockingsolution（瓶号6）•未开启时，在15~25℃条件下稳定•开启后，请将母液分装，于2~8℃或15~25℃条件下保存，在保证无菌的情况下可稳定保存1月•每次实验，请新鲜配制工作液灵敏度和特异性1μg人胎盘DNA酶切消化后，进行Southernblot检测，可检出人单拷贝基因。注意：试剂盒检测灵敏度决定于杂交实验中标记DNA的使用浓度，以及显色反应时间。优势实验优势试剂盒特性准确、快速DIG-HighPrime为高效预混反应液，减少手工步骤的同时，增加标记核酸的得率和标记反应重复性灵敏度高在人和植物等复杂基因组中可检出单拷贝基因节省试验时间DIG标记的探针可稳定保存至少一年。杂交反应时，杂交液可重复使用3~5次（根据每次杂交反应中消耗的探针量决定重复使用次数）。73.实验步骤和需要的材料3.1实验开始前准备实验操作建议建议指导请在洁净条件下进行实验•将杂交检测溶液进行灭菌处理•含SDS的溶液过滤除菌•将Tween20加入到经灭菌的溶液使用洁净的孵育容器所有孵育容器在使用前经严格洗涤和漂洗膜操作要求•戴无粉手套进行操作•使用洁净的镊子，仅对膜的边缘进行操作实验步骤3.2DIG-DNA标记3.3定量标记反应效率3.4DNA转膜和固定3.5杂交3.6免疫检测3.7探针洗脱和重探3.2DIG-DNA标记反应原理利用随机引物法和地高辛标记的核苷酸DIG-11-dUTP对DNA进行标记，获得探针。DIG-HighPrime为优化的5×预混反应液，包括含DIG-dUTP（碱不稳定）的dNTP混合液，随机引物，标记级别的Klenow酶和优化的反应缓冲液。反应所需的仪器和其他试剂•水浴设备•冰或冰水浴试剂成分保存条件用途水水，PCR级别15~25℃，可稳定保存DNA稀释EDTA0.2MEDTA，pH8.015~25℃，可稳定保存终止标记反应8DNA模板请见下表的DNA模板建议模板特性具体建议纯度使用HighPurePlasmidIsolationKit*进行质粒DNA纯化。如使用其他商业化试剂盒进行质粒纯化，建议在反应后进行酚/氯仿抽提，去除残留蛋白。如模板经限制性酶切或其他修饰酶处理，在进行标记反应前应进行酚/氯仿抽提，去除残留蛋白。片段大小为获得最佳标记结果，建议将DNA模板线性化处理，模板片段长度至少100bp。如DNA模板5kb，使用4bp切口的限制性内切酶进行酶切处理。模板浓度•使用下述步骤可成功标记10ng-3μg的DNA模板。请根据具体的杂交反应确定您将使用的探针量。•如需检测复杂基因组中的单拷贝基因，建议至少使用300ngDNA模板进行标记反应，杂交反应时探针浓度采用25ng/ml。•标记反应的试剂用量和反应体积可成比放大，以制备大量探针。凝胶中回收DNA模板如果您进行的是基因组Southernblotting实验，应通过凝胶电泳将质粒中插入的模板DNA进行切胶回收。建议使用HighPurePCRProductPurificationKit*或AgaroseGelDNAExtractionKit*，获得更好的DNA回收结果。反应步骤下述步骤用于10ng-3μgDNA模板的标记反应。如需大量标记（多至10μgDNA），请成比例放大标记反应的试剂用量和反应体积。步骤操作1取一反应管，将1μgDNA模板（线性或超螺旋）加入无菌双蒸水，至终体积16μl。2DNA模板通过沸水浴10min，进行变性处理。变性后立即将反应管置于冰上。注意：要获得高效的标记反应，模板必须完全变性。3•将DIG-HighPrime（管1）混合均匀，取4μl加入经变性的DNA，混匀后简单离心。•37℃孵育1h或反应过夜。注意：延长孵育时间（可至20h）将增加DIG标记DNA的得率（参考下表）。4加入2μl0.2MEDTA（pH8.0）终止反应。（可选：65℃孵育10min。）注意：DIG-HighPrime反应获得的DIG标记DNA的片段长度与初始DNA模板的长度相关，一般在200bp~1000bp。9标记反应得率表1：DIG-HighPrime不同反应时间的标记反应得率DNA模板量1h20h10ng45ng600ng30ng130ng1050ng100ng270ng1500ng300ng450ng2000ng1000ng850ng2300ng3000ng1350ng2650ng在DIG-HighPrime标准反应体系中（1μgDNA模板），反应1h后，15%的核苷酸掺入到新合成的探针，DIG标记的探针约为0.8μg；反应20h后，38%的核苷酸掺入到新合成的探针，DIG标记的探针约为2μg。图2：DIG-HighPrime法不同DNA模板量的标记反应得率，37℃反应1h或20h103.3定量标记反应效率定量原理DIG标记DNA的得率是杂交反应优化和反应重复性的决定性参数。杂交时使用的探针浓度过高将引起严重的背景，浓度过低将影响杂交信号的获得。建议通过直接检测的方法定量DIG标记DNA探针的得率。步骤描述1•剪一条带正电荷的尼龙膜*，将DIG标记DNA系列稀释后分别点样于膜上。•将浓度已知的DIG-labeledControlDNA（管2）进行系列稀释，点样于膜上，作为参照标准。2•通过anti-digoxigenin-APconjugate（管4）和NBT/BCIP