DNA、RNA、质粒提取-RACE技术以及基因克隆

实验一总RNA的提取取样：将罗氏沼虾活体解剖，迅速取卵巢组织约100mg于1.5ml的离心管中，置液氮罐冷冻备用。用Trizol试剂提取总RNA：1.每个离心管加1mLTrizol试剂于冰上碾碎组织2.碾碎后在30℃恒温箱中保存5分钟3.每1mLTrizol加0.2mL氯仿，用手震荡15秒，放30℃恒温箱中3分钟（使RNA溶于水相）4.离心：低温4℃，12000g，15分钟5.取上层水相到另一干净离心管6.每1mLTrizol加0.5mL异丙醇，30℃恒温箱中10分钟（异丙醇的作用是通过-OH的疏水作用使得RNA或者DNA链中的亲水基团受到保护，等同于沉淀，但是这是个反应时发生在水相中，与前面的氯仿不矛盾。）7.离心：低温4℃，12000g，10分钟8.清洗RNA：移去上清，每1mLTRIzol加入1mL75%酒精，用移液枪反复吹洗打散9.离心：低温4℃，7500g，5分钟10.乙醇析出，可见白色沉淀于管壁，自然干燥15分钟11.用30μLDEPC直至完全溶解，然后放置于-80℃冰箱保存。焦碳酸二乙酯，强烈但不彻底的RNA酶抑制剂12.1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量13.测OD值TRIzol使样品匀浆化，细胞裂解，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。在加入氯仿离心后，溶液分为水相和有机相，RNA在水相中。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA；用异丙醇沉淀有机相可回收蛋白质。实验二cDNA第一条链的合成1)OligodTPrimer(50μM)1μldNTPMixture(10mMeach)1μlTotalRNA(1000ng/μl)1μlRnasefreedH2O7μl反应条件：65℃5min,急冷2min2)上述变性、退火后反应液10μl5×PrimeScriptBuffer4μlRNaseInhibitor(40U/μl)0.5μlPrimeScriptRtase反转录酶1μlRNaseFreedH2O4.5μl总共20μl反应条件：42℃60min，70℃15min，4℃∞实验三重组DNA的制备（设计性实验）【实验目的】1.了解PCR的含义，掌握体外大量扩增DNA的方法。2.认识和学习连接酶的性质和作用以及载体（pGM-T载体）的特性。3.认识互补现象，理解重组DNA的筛选、鉴定方法。【实验原理】重组DNA的制备过程需要多个相关环节，其中优化PCR反应条件，目的基因与克隆载体连接、转化和重组DNA的筛选是关键步骤。根据扩增DNA片段长度和引物的Tm值，选择合适的延伸时间和退火温度。目的DNA和载体的摩尔比例关系影响连接效率。外源DNA与感受态细胞热激是较常用的转化方法。利用互补现象筛选重组DNA，pGM-T载体带有一个大肠杆菌DNA的短片段，含有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和头146个氨基酸的编码信息（β-半乳糖苷酶的N端），它可与E.coliDH5编码的β-半乳糖苷酶的C端形成互补，使生色底物X-gal显蓝色。如有外源DNA插入，互补被破坏，则形成白色菌落。然后应用酶切和琼脂糖电泳技术鉴定重组DNA。【实验药品与器材】PCR仪，电泳仪，微量移液器，微量恒温器，恒温培养箱，恒温摇床，超净工作台，DNA凝胶回收试剂盒，T载体试剂盒，引物，模板DNA，琼脂糖，5×TBE电泳缓冲液，EB，大肠杆菌（DH5）感受态，LB液体培养基，LB固体培养基，X-gal，IPTG，摇菌管，1.5ml、0.2ml离心管，涂布器，枪头等。【实验步骤】（一）PCR检测：25μl反应体系模板：1μl水：15.8μlBuffer：4μldNTP：2μl上下游引物：各1μl酶：0.2μl反应条件，Tm：55℃；30循环（二）电泳：1、试验目的：依据核酸的相对分子量分离核酸。通过已知大小的标准物移动的距离与未知片段的移动距离进行比较，推测出未知片段的大小。2、试验材料：电泳仪、琼脂糖、缓冲液、微波炉、胶板、做胶槽3、试验步骤：1.1%浓度的胶：称取0.15g的琼脂糖，加入15ml的0.5×TBEbuffer。放入微波炉加热，使琼脂糖完全溶解混匀。当胶溶液稍微冷却后，加入7.5ulEB，混匀后倒入做胶板中。三十分钟后取出。2.点样：5μl的DNA样品和1μl的上样缓冲液混合后加入胶孔中。3.电泳：100V，30min左右。（三）割胶纯化一、试验目的：掌握一种纯化DNA的方法二、试验材料：刀片、移液枪、灭菌枪头、离心机、1.5离心管。三、试验步骤：1.柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中）加入500µl平衡液BL，12,000rpm(~13,400×g)离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。2.将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中。向胶块中加入3倍体积溶胶液PN（如凝胶重为0.1g，其体积可视为100µl）。50℃水浴放置10分钟，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可再补加一些溶胶液或继续放置几分钟，直至胶块完全溶解（若胶块的体积过大，可事先将胶块切成碎块）。注意：胶块完全溶解后最好将胶溶液温度降至室温再上柱，因为吸附柱在较高温度时结合DNA的能力较弱。3.将上一步所得溶液加入一个吸附柱CA2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2分钟，12,000rpm(~13,400×g)离心30－60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。注意：吸附柱容积为800µl，若样品体积大于800µl可分批加入。4.向吸附柱CA2中加入600µl漂洗液PW（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm(~13,400×g)离心30－60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CA2放入收集管中。5.向吸附柱CA2中加入600µl漂洗液PW，12,000rpm(~13,400×g)离心30－60秒，倒掉废液。6.将吸附柱CB2放回收集管中，12,000rpm(~13,400×g)离心2分钟，尽量除去漂洗液。将吸附柱CB2置于室温放置数分钟，彻底地晾干，以防止残留的漂洗液影响下一步的实验。注意：漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切，PCR等）试验。7.将吸附柱CB2放入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加30-50µl洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟。12,000rpm(~13,400×g)离心2分钟收集DNA溶液。（四）连接试验步骤：1.将载体在冰上融化，离心数秒。2.在无菌离心管中加入以下成分：PCR纯化产物5μl，载体1μl，Buffer1μl，水2μl，连接酶1μl。3.清弹混合物，短暂离心。16℃过夜。（五）转化：将获得的重组质粒转入感受态细胞DH5中。试验步骤：1.取出-80℃保存的感受态细胞DH5，在冰上融化。2.将10ul的连接液加到100ul感受态细胞中，混匀，冰上放置30分钟。3.42℃水浴热激90秒，迅速将管子放到冰上冷却2-3分钟。4.加入900ulLB培养基，混匀后37℃，150rpm摇床培养45分钟。5.台式离心机中4000rpm离心2分钟，吸去800ul上清液，混匀剩余的菌液，吸取100ul涂LB固体平板（含Amp抗生素），37℃过夜培养（12-16小时）。利用互补现象筛选重组DNA。平板制作：在LB琼脂板中央滴加40ul2%X-gal和7ul20%IPTG，用无菌的涂布器涂匀，37℃温育至全部液体被吸收。（六）鉴定用牙签挑取白色单菌落于4mLB液体培养基中，37℃摇床过夜培养，准备次日提质粒做酶切鉴定。实验四碱变性法提取质粒DNA（小规模）【目的】学习制备质粒DNA技术，掌握常用的小规模提取质粒DNA的一种方法。【原理】碱变性法制备质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA变性和复性的差异而达到分离的目的。在强碱条件下，染色体DNA变性，双螺旋结构解旋、氢键断开；而质粒DNA的超螺旋结构的氢键不会完全断开。因此在中性条件下，质粒DNA又恢复到原来的结构；而染色体DNA呈网状结构，不能复性到原来的状态。这样通过离心，染色体DNA与其它大分子物质一起下沉而被除去。【实验材料】1.实验器具：超净工作台，恒温振荡器，台式离心机，电泳仪，微波炉，电子天平，酒精灯，微量移液器，试管，1.5ml离心管，牙签。2.菌种：大肠杆菌DH5（含pGM-T重组质粒）。3.试剂：LB液体培养基，TIANprep质粒小提试剂盒，TBE电泳缓冲液，琼脂糖，6×上样缓冲液，200bpDNAmarker，EB。【步骤】1.在超净工作台中，用牙签挑取单个白色菌落，接种到4mlLB液体培养基中，37℃振荡培养过夜（12—16h）。2.柱平衡步骤：向吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管中）加入500µl的平衡液BL，12,000rpm(~13,400×g)离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。3.吸取3ml菌液，加入两个1.5ml离心管中，12,000rpm离心1分钟，尽量吸除上清液。4.向3ml菌液沉淀中加入250µl溶液P1（请先检查是否已加入RNaseA），使用移液器彻底悬浮细菌沉淀。5.向离心管中加入250µl溶液P2，温和地上下翻转6－8次，至菌液清亮粘稠，裂解反应时间不能超过5分钟，以免质粒受到破坏。注意：温和地混合，不要剧烈震荡，以免打断基因组DNA，造成提取的质粒中混有基因组DNA片断。6.向离心管中加入350µl溶液P3，立即温和地上下翻转6–8次，充分混匀，此时将出现白色絮状沉淀。12,000rpm离心10分钟。7.将上一步收集的上清液用移液器转移到吸附柱CP3中（吸附柱放入收集管），注意尽量不要吸出沉淀。12,000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。8.向吸附柱CP3中加入600µl漂洗液PW（请先检查是否已加入无水乙醇），12,000rpm离心30-60秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。9.重复步骤8.10.12,000rpm离心2分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。11.将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加50-100µl洗脱缓冲液EB，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟将质粒溶液收集到离心管中。12.酶切鉴定重组质粒DNA：重组质粒DNA1ug10×bufferEcoRⅠ2ulEcoRⅠ1ulddH2Oupto20ul37℃,2h.。电泳检测。实验五提取中华绒螯蟹肌肉中基因组DNA一、试验目的：掌握一种提取基因组DNA的方法。二、实验原理：采用细胞裂解液裂解细胞，加入蛋白酶K除去蛋白，然后用氯仿抽提DNA，最后用RNA酶处理，获得基因组DNA三、试验材料1.实验器具：移液抢、灭菌枪头、离心管、恒温仪、高速离心机、研钵、研磨棒。2.实验对象：中华绒螯蟹3.试剂：氯仿、无水乙醇、TE。四、方法步骤：1.准备：25-30mg中华绒螯蟹肌肉在液氮中研碎，将粉末收集到1.5ml离心管中，用200μlTE悬浮。注意避免多次冻融样品，每次冻融都大大降低完整DNA的产率。2.200μl样品加400μlcelllysissolution混匀，再加入6μlProteinaseK混匀，置于55℃水浴5-10min。其间上下混匀几次，延长消化时间到30min可能效果更好。3.加入600μl氯仿（自备）混匀，不能太剧烈，以保证DNA的完整性。4.在台式离心机上，10000转/分，室温离心2min。此时应分成三层，基因组DNA在上层中，如未能分层，表明样品与氯仿未混匀。取500μl上层清液，置于无菌1.5ml离心管中。5.加入500μlPrecipitationSolution混匀，室温放置2min。10000转/分，离心2min。6.吸去上清，注意不要吸到沉淀，立即加入100μl，1.2mol/lNaCl,轻轻振荡直至DNA样品完全溶解，加入3μlRNaseA，置于37℃5-10min，以除去RNA。7.加入300μl冰冷乙醇（自备），-20℃放置10min。100