制备感受态细胞的实验报告

制备感受态细胞的实验报告一、实验目的掌握制备化学感受态细胞和电转化感受态细胞的方法和步骤。二、实验原理1.感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后，必须导入特定的宿主（受体）细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。所谓的感受态，即指受体（或者宿主）最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是由受体菌的遗传性状所决定的，同时也受菌龄、外界环境因子的影响。cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。细胞的感受态一般出现在对数生长期，新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存（有效期6个月）。在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内，使之获得新的遗传特性的一种方法。它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一。受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。化学制备法：大肠杆菌的转化常用化学法（CaCl2法），该法最先是由Cohen于1972年发现的。其原理是细菌处于0℃，CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中，重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上，可选出所需的转化子。Ca2+处理的感受态细胞，其转化率一般能达到5×106~2×107转化子/ug质粒DNA，可以满足一般的基因克隆试验。如在Ca2+的基础上，联合其它的二价金属离子（如Mn2+、Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，则可使转化率提高100~1000倍。化学法简单、快速、稳定、重复性好，菌株适用范围广，感受态细菌可以在-70℃保存，因此被广泛用于外源基因的转化。物理制备法：电转法（原理待续除化学法转化细菌外，还有电击转化法，电击法不需要预先诱导细菌的感受态，依靠短暂的电击，促使DNA进入细菌，转化率最高能达到109~1010转化子/ug闭环DNA。因操作简便，愈来愈为人们所接受。效价的计算公式：三、实验步骤1.菌种活化菌种保存在—70度的超低温冰箱2.前培养将单菌落接种到10ml的培养液中，在恒温振荡器37°下过夜培养3.培养基的制备200ml液体培养基：加水150ml于烧杯中，加2g蛋白胨，1g酵母粉，2gNacl定容200ml在磁力搅拌器中搅拌200ml固体培养基：在液体的基础上，加琼脂3g在把液体与固体放到高压灭菌锅里121℃20minutes第二天接种菌液4ml到培养基中在恒温振荡箱中培养一夜化学方法：（以大肠杆菌感受态制备为例）1)测培养液（振荡了一夜的）OD600若0.6A(在0.4~0.5之间即可)2)每人取50ml菌液到离心管4000rpm4℃10minutes，去上清液3)在菌体中加20ml中加0.1mol氯化钙水溶液（目的：将细菌彻底悬浮分散开来）然后冰浴30min离心4）倒上清液，加10ml0.1mol氯化钙(10%的甘油)悬浮后离心5）在收集菌体加150ml0.1mol氯化钙悬浮6）分装（40ml每管）液态冷冻电转化1)接种：在200ml的LB液体培养基加入1ml的前培养2)培养：OD值在0.4~0.5之间即可离心后将已培养好的放到冰里摇晃3)水洗1加水30~40ml悬浮离心水倒掉水洗2加20ml水离心水倒掉水洗3加10ml水离心水倒掉4)甘油10%洗2次（每次加5ml）中间离心两次在第二次加甘油悬浮后离心后加120uLGYT悬浮液5)一个人准备4个小管子（每个40uL扔到液氮速冻放到-70℃保存）效价检测：根据加入2uL的菌体液体培养出的菌落数若为N个，则计算效价X的公式推导为N/X=1000/10^10则x=N*10^7效价：指能用1ug的标准质粒能够转化出的菌落数。具体步骤化学效价检测A.把感受细胞从超低温冰箱中拿出(冰水先准备好再拿出感受态细胞在冰水中慢慢溶化)B.加1uL标准质粒于40uL的感受细胞中（用手指轻弹）C.在42℃的干式恒温器90秒(热休克)D．再放到冰上2分中不超过2分E．之后迅速加入已预热好的37℃LB160uL复苏45分F.播盘:2uL（200uL能长10^5个，所以2uL10^3到达10^6即可用(50Ul~100Ul若这里不能长到10^6则不可用)电转化效价1.取Pug19uL加入感受态细胞再将此移到电击杯2.下电击杯，让液体到底部3.在将电击杯放入电击转化仪电击下，再加入160uL预热好的LB4.再用移液枪200多uL从电击杯总吸出放出10mL管中(封住)5.再放到恒温振荡箱60min四．实验结果化学检测结果菌数4*10^7电转化检测结果菌数10^9五．实验分析步骤至关重要，在播盘的过程中，注意一些操作，不然会导致实验结果的偏差。悬浮细胞时要小心，用枪头轻轻吹起细胞即可，否则会影响细菌活性涂布前玻璃棒要充分冷却，不然会因为温度过高而烫死细菌涂布时，尽量每个角落都要涂到，在一个角落涂布后，要顺时针90度再涂布，连续转两次*注意无菌操作操作过程中要尽量迅速以确保细菌细胞的活性六．讨论为了提高转化效率，试验中要考虑一下几个重要因素：1.细胞生长状态和密度2.质粒的质量和浓度3.试剂的质量4.防止杂菌和杂DNA的污染