蛋白纯化-Ni亲和层析柱法

Ni亲和层析柱法纯化带组氨酸标签的重组蛋白纯化设备：纯化仪：ÄKTApurifier(GEHealthcare,Uppsala,Sweden)Ni亲和层析柱：HisTrapTMHP-5mL(GEHealthcare,,Uppsala,Sweden)试剂：所有上柱的试剂均需经0.2µM孔径过滤器过滤并超声波震荡除气处理方可使用。BindingBuffer：20mMNa2HPO4-NaH2PO4,pH7.4,500mMNaCl,5mM咪唑ElutionBuffer：20mMNa2HPO4-NaH2PO4,pH7.4,500mMNaCl,500mM咪唑StrippingBuffer:20mMNa2HPO4-NaH2PO4,pH7.4,500mMNaCl,50mMEDTA20%乙醇：200mL无水乙醇，加蒸馏水定容至1L0.1MNiSO4:称取2.6284gNiSO4·6H2O，加蒸馏水溶解，定容至100mL操作步骤：1样品前处理取诱导后菌液50mL，4℃、5000rpmin离心10min收集菌体，以25mLBindingBuffer重悬菌体，冰浴下超声波破碎至澄清，4℃、12000rpmin离心25min，取上清，经0.2µM孔径过滤器过滤后待用。2Ni柱前处理上样前，使用10倍柱体积的BindingBuffer以5mL/min的流速平衡镍柱。3上样经离心、过滤处理后的样品以1mL/min的流速通过衡流泵加载到平衡后的Ni柱上，收集穿透液，可反复上样以提高样品的挂柱效率。4平衡上样后的Ni柱将已结合目的蛋白的Ni柱回接到ÄKTApurifier上，用10倍柱体积的BindingBuffer以5mL/min的流速再次平衡镍柱以去除未结合上的蛋白。5梯度洗脱以梯度的ElutionBuffer/BindingBuffer混合液洗脱Ni柱(梯度的界定因蛋白而不同，可经预实验确定)，流速为5mL/min，并监测OD280值，收集蛋白吸收峰对应的洗脱液，经SDS-PAGE检测后确定目的蛋白所在。6Ni柱的清洁及保存以10个柱体积的ElutionBuffer彻底洗脱Ni柱，除去残余的柱结合蛋白；而后用5-10个柱体积的20%乙醇平衡Ni柱；取下Ni柱，于室温下保存。7关闭纯化系统及电脑8Ni柱的彻底清洗及再生对使用过的Ni柱进行彻底清洗并再生后方可用于其他蛋白样品的纯化。8.1Ni的剥离(Stripping)A5-10个柱体积的StrippingBuffer洗脱Ni柱，剥离Ni离子B(可选)若Ni柱因非特异性结合杂蛋白的沉积而难以仅通过剥离Ni而彻底清洁时，可采用1MNaOH洗脱Ni柱1-2h以除去杂蛋白。C5-10个柱体积的BindingBuffer洗脱Ni柱D5-10个柱体积的蒸馏水洗脱Ni柱8.2Ni柱再生(Recharging)A用2.5mL的0.1MNiSO4洗脱上述Ni柱B用5个柱体积的蒸馏水洗脱Ni柱C用5个柱体积的BindingBuffer平衡Ni柱9Ni柱保存将Ni柱保存在20%的乙醇中，即以5-10个体积的20%乙醇平衡Ni柱