重组子的筛选

第三节重组子的筛选在重组DNA分子的转化、转染或转导过程中，一般仅有少数受体细胞成为克隆子。必须采用合适的方法从大量的细胞背景中筛选出期待的克隆子。概念克隆子转化子重组子将摄取外源DNA分子并能使该分子在其中稳定维持的受体细胞统称为克隆子。把采用各种转化方法或转导方法获得的克隆子叫做转化子（导入外源DNA分子后能稳定存在的受体细胞称为转化子），现在这两者有通用的趋向。含有重组DNA分子的克隆子被称为重组子，如果重组子中含有外源目的基因则又称为阳性克隆子或期望重组子。经过各种方法将外源DNA分子导入受体细胞后，获得所需阳性克隆子的过程称为克隆子的筛选。一、遗传表型直接筛选法（一）根据载体选择标记初步筛选转化子在构建基因工程载体系统时，通常在载体DNA分子中组装了一种或两种选择标记基因，在受体细胞内进行表达，呈现出特殊的表型或遗传学特性，作为筛选转化子的依据。一般的做法是:将转化处理后的受体细胞接种在含适量选择药物的培养基上，在最适生长温度条件下培养一定时间，根据菌落生长情况挑选出转化子。常用的选择标记基因主要是：抗性基因；表达产物可以发光或使反应底物显色的基因相应的选择条件是：可以被抗性基因产物分解的抗生素；可以使基因产物发光的光线，或者是可以使基因产物显色的试剂。选择培养基是：根据宿主细胞类型配置的培养基，对于细菌受体细胞而言，通常用LB培养基，在LB培养基中加入适量的某种选择物，即为选择培养基。选择物：是由载体DNA分子上携带的选择标记基因所决定。（一）根据载体选择标记初步筛选转化子（1）抗药性筛选（2）插入失活筛选法（3）插入表达筛选法（4）显色互补筛选法（5）利用报告基因筛选植物转化细胞（6）利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞（1）抗药性筛选正向选择方式若外源DNA插在BamHⅠ位点上，培养基应含Ap；若外源DNA插在PstⅠ位点上，培养基应含Tc；利用含一种选择药物的选择培养基无法区分重组子和非重组子，只能区分转化子和非转化子。抗药性筛选（2）插入失活筛选法双双双双抗药性筛选双（3）插入表达筛选法利用外源目的基因插入特定载体后能激活筛选标记基因的表达，由此进行转化子的筛选。有些载体在设计时，在筛选标记基因前面连接上一段负调控序列，当插入失活该负调控序列时，其下游的筛选标记基因才能表达。例如pTR262质粒载体，它由pBR322衍生而来，其Tcr基因的上游含有一段λ噬菌体DNA的CI阻遏蛋白编码基因及其调控序列，CI基因表达的阻遏蛋白可以抑制Tcr基因的表达。当外源DNA片段插入CI基因的HindⅢ或BglⅠ位点上时，CI基因失活。Tcr基因因阻碍解除而得以表达，故阳性重组子为Tcr表型。质粒本身因为Tcr基因受阻碍为Tcs表型，当转化细菌涂布在Tc平板上时，只有含有外源DNA插入片段的阳性重组子的转化菌才能生长成菌落。（4）显色互补筛选法lacZ基因上缺失操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性突变体之间实现互补，这种互补现象称为α-互补。具有完整乳糖操纵子的菌体能转译β-半乳糖苷酶(Z)、IPTG和X-gal时，产生兰色沉淀物，使菌落成为蓝色。如果在载体DNA上组入β-半乳糖苷酶基因（lacZ)部分缺失的片段(lacZ’)．则重组DNA分子转化lacZ’互补型菌落，会在含有X-gal和IPTG的培养基中得到的转化子是蓝色菌落。lacZ’是β-半乳糖苷酶基因部分缺失的DNA片段，含lacZ’的重组载体转化lacZ’互补型菌株，可转译β-半乳糖苷酶，在含有X-gal（5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷）和IPTG（异丙基-β-硫代半乳糖苷）的培养基上使转化子成为蓝色菌落，而lacZ’互补型菌株本身为白色菌落。当lacZ’区插入外源基因后，再转化lacZ’互补型菌株，由于不能翻译β-半乳糖苷酶，转化子即使在含有X－gal和IPTG的培养基上也只能长成白色菌落。这样可以区分含外源基因和不含外源基因的转化子。此方法主要用于原核生物。α互补的检测以显色剂x-gal作为选择物时:DNA对照组不应出现任何菌落；感受态细胞对照组长出的菌落应全是蓝色的；感受态细胞有效性对照组长出的菌落中应有白色的。其中一项不符，就有可能挑出假的转化子菌落。（5）利用报告基因筛选植物转化细胞报告基因：系指其编码产物能够被快速地测定，常用来判断外源基因是否已经成功地导入寄主细胞（器官或组织）并检测其表达活性的一类特殊用途的基因。在植物转基因研究中，在有选择压力的情况下，可利用报告基因在受体细胞内的表达，从大量非转化克隆中选择出转化细胞；同时，报告基因可以和某些目的基因构成嵌合基因，从报告基因的表达了解目的基因的表达情况及推测基因调控序列。常用的报告基因有抗生素抗性基因以及编码某些酶类或其他持殊产物的基因等。特征作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：(1)已被克隆和全序列已测定；(2)表达产物在受体细胞中本不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；(3)其表达产物能进行定量测定。①新霉素磷酸转移酶基因（nptⅡ）抗新霉素、卡那霉素、庆大霉素和G418等抗生素，成为筛选动植物转化子的选择标记基因。②潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）赋予转化子能抗潮霉素，作为选择标记基因主要用于筛选动植物转化子。潮霉素是致癌物质，操作时应慎重。③氯霉素乙酰转移酶基因（cat）也被用于筛选动植物转化子的标记基因。④β-葡萄糖酸酶基因（gus）gus的基因产物β-葡萄糖酸酶（GUS）能够催化4-甲基伞形花酮-β-D-葡萄糖苷酸，产生荧光物质4-甲基伞形花酮，以此筛选含gus基因的转化子。由于植物细胞GUS本底非常低，因此广泛地应用于筛选植物转化子。尤其是gus基因的3’端与其他结构基因连接产生的嵌合基因仍能正常表达，产生的融合蛋白中仍有GUS活性，可用于外源基因在转化生物体中的定位分析。⑤萤火虫荧光素酶基因（luc）luc表达产物萤火虫荧光素酶（LUC）在Mg2+的作用下，可以与荧光素和ATP底物发生反应，形成与酶结合的腺苷酸荧光素酰化复合物，经过氧化脱羧作用后，该复合物转变成为处于激活状态的氧化荧光素，可以用荧光测定仪快速灵敏地检测出产生的荧光，是目前研究动植物转基因很好用的一种报告基因。Luc基因检测十分迅速，灵敏度高，成本低，不存在放射性同位素检测对人体健康和环境生态所造成的危害，也没有内源荧光产生的背景干扰，因此，Luc是一种理想的报告基因。⑥抗除草剂bar基因。bar基因编码磷化乙酰转移酶（PAT），使转化子对含有磷化麦黄酮（PPT）成分的除草剂具有抗性。⑦冠瘿碱合成酶基因。主要包括胭脂碱合成酶基因和章鱼碱合成基因两类，存在于土壤农杆菌Ti质粒的T-DNA区段。冠瘿碱合成酶基因在植物细胞中的表达产物可以催化一些特殊反应，通过电泳分离及菲醌荧光染料染色，方便地观察，据此作为报告基因用于转植物基因细胞的筛选。冠瘿碱合成酶基因在植物基因工程早期应用较多，现已逐渐被其他更为理想的报告基因所取代。（6）利用遗传选择标记筛选哺乳动物转基因细胞在植物转基因研究中采用的氯霉素乙酰转移酶(Cat)基因和新霉素磷酸转移酶(NptⅡ)基因也可用于哺乳动物转基因细胞的筛选。常用的标记基因还有：--胸腺核苷激酶基因（tk）、--二氢叶酸还原酶基因（dhfr）--次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因（hgprt）--细菌的黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因(ecogpt)等。胸腺核苷激酶基因（tk）、二氢叶酸还原酶基因（dhfr）及次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因（hgprt）等的表达产物直接或间接参与核苷酸合成代谢。这些基因缺失的缺陷型细胞因核苷酸合成代谢失调而死亡，只有在添加某些核苷酸的培养基中才能生长。如果用这样的缺陷型细胞作为受体细胞，导入含有上述基因的外源DNA，补充原来缺失的基因，使核苷酸合成代谢恢复正常，可以在不添加核苷酸的培养基中正常生长。根据这一性质可以在不添加核苷酸的培养基中筛选出转化子。二、核酸分子杂交检测法（p297）基本原理复性RNADNA待测的核酸序列杂交的双方用于检测的已知核酸片段—探针根据待测核酸的来源以及将其分子结合到固相支持物上的方法的不同。Southern印迹杂交Northern印迹杂交斑点和狭线印迹杂交菌落（或噬菌体）原位杂交核酸分子杂交检测法分类又称DNA印迹杂交、SouthernDNA印迹杂交1、Southern印迹杂交基本原理：（1）提取总DNA（2）酶解（3）电泳（4）转印（5）变性解链（6）杂交（7）洗脱（8）放射自显影（9）比较分析毛细管虹吸印迹法电转移印迹法真空转移法核酸转移（印迹）方法毛细管虹吸印迹法湿滤纸高盐缓冲液滤纸桥凝胶硝酸纤维素膜吸水纸玻璃板支持台容器重物利用核酸分子在电场中的电泳作用将凝胶中的DNA转移到固相支持物上。湿式电转移干式电转移电转移法尼龙膜凝胶滤纸海绵凝胶支持夹缓冲液电极+–滤纸电极湿式电转移法真空转移法真空转移装置①硝酸纤维素膜（简称NC膜）优点：吸附能力强，杂交信号本底低缺点：DNA分子结合不牢固，膜易碎裂，依赖高盐溶液常用的固相支持物②尼龙膜（Nylon）优点：结合单链，双链DNA的能力比NC膜强，韧性高，可重复杂交缺点：杂交信号本底高常用的固相支持物southern印迹杂交实验仪器凝胶滤膜转移RNA至膜上RNA分子甲醛变性电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳）带有RNA片段的凝胶转膜杂交、显影2、Northern印迹杂交两种印迹技术的比较3、斑点印迹杂交和狭线印迹杂交两种方法的基本原理和操作步骤相同——即通过特殊的加样装置将变性的DNA或RNA核酸样品，直接转移到适当的杂交滤膜上，然后与核酸探针分子进行杂交以检测核酸样品中是否存在特异性DNA或RNA。斑点杂交法狭缝式点样器1、斑点印迹为圆形2、狭缝印迹为线状3、鉴别DNA、RNA4、简单、快速，同一张膜可检测多个样品5、特异性不高、不能鉴别核酸分子量斑点及狭缝印迹杂交的特点4、菌落（或噬菌斑）原位杂交基本原理直接把菌落和噬菌斑转移到滤膜上溶菌、变性DNA暴露并于滤膜原位结合与探针杂交溶菌、使DNA暴露洗菌体碎片和Pr使单链DNA牢固结合在膜上操作用途Southern印迹杂交从转化子中提取总DNA，经酶切、电泳分带及变性，转移膜上，再用DNA探针与其杂交。操作麻烦。鉴定转化子中是否含有待检测重组DNA分子；鉴定待检测的DNA分子的大小。斑点印迹杂交把提取的转化子总DNA直接点样到膜上，变性处理后再用DNA探针与其杂交。操作简单。只能区别总DNA中是否含有待检测重组DNA分子的重组子菌落（或噬菌斑）原位杂交直接把菌落或噬菌斑印迹转移到膜上，经溶菌和变性处理后使DNA暴露出来并与滤膜原位结合，再用DNA探针与其杂交。操作简单。广泛地用于从基因组DNA文库和cDNA文库中筛选含目的基因的重组子。三种筛选方法的比较杂交探针——指具有一定序列的核苷酸片段，它能与互补的核酸序列复性杂交，并且通过适当标记进行检测。5、核酸杂交探针①同源或部分同源探针②总cDNA探针③特异性cDNA探针④人工合成的寡核苷酸探针（1）核酸杂交探针的种类理想的探针标记物应满足的条件：1)不会影响探针的主要理化性质；2)检测灵敏度高、特异性强、本底低、重复性好；3)操作简便、省时．经济实用：4)化学稳定性高、易于长期保存；5)安全、无环境污染。常用于分子杂交的探针标记物分放射性及非放射性。（2）探针标记物放射性标记物是指以放射性同位素对核苷酸等进行标记后的产物，常见的放射性同位素有32P、3H、35S、14C、125I等，其中以32P、3H、35S最为常用。标记物放射性的检测主要使用盖革计数器和液体闪烁计数器等射线探测仪来完成。①放射性标记物非放射性标记物的最大优势是无放射性污染，分辨力高，稳定性好，可以较长时间保存使用，但与放射性探针相比，多数非放射性探针的敏感性及特异性较差。目前已广泛应用的非放射性标记物有：生物素(biotin)标记的核苷酸、地高辛(digoxigenin)标记的核苷酸荧光素