ELISA的基本原理和质量控制

ELISA的基本原理及质量控制ThefundamentalprincipleandqualitycontrolofELISAELISA（Enzyme-linkedimmunosorbentassay——酶联免疫吸附实验）是20世纪60年代发展起来的免疫学检测技术，也是目前应用最广泛的传染病检测方法。ELISA的特点：敏感度和特异度较高，重复性好。试剂比较稳定，易于保存。操作简单，价格便宜，易于在基层大规模使用。易于标准化和对检测对象进行定量。可以自动化。ELISA的基本原理抗原或抗体在体外结合到某种固相载体表面后，仍然能保持其免疫学活性而能相互特异性结合。将抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体后，这种酶标抗原或抗体既能保留与相应抗体或抗原结合的免疫活性，又同时保留酶的活性。由于酶具有很高的催化效率，因此可放大抗原抗体反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感性。抗原抗体复合物与酶标的二抗结合，加入合适的底物在酶的作用下显色，颜色的深浅与特异性抗体水平成比例关系，可进行定性和定量分析。间接法ELISA间接法ELISA（IndirectELISA）——将特异性抗原包被于固相载体表面，与标本中相应特异性抗体结合，洗涤后再加入酶标的抗人IgG或IgM抗体与之结合，洗涤后加入底物显色。1.加样2.孵育3.洗涤4.加入二抗5.孵育6.显色间接法ELISA使用RF吸附剂类风湿因子（10％）是一种自身抗体，主要有IgM组成，能与抗原抗体复合物的FC段结合，非特异性IgM抗体（风湿因子）的存在将导致IgM检测出现假阳性结果。麻疹IgG麻疹抗原麻疹IgM抗人酶标IgM抗体类风湿因子RF吸附剂的组成RF吸附剂———人IgG抗体ProteinA羊抗人IgG因此，在使用间接法ELISA进行IgM检测前应用类风湿因子吸附剂对血清作预处理。捕获法ELISA捕获法ELISA（CaptureELISA）——专门用来检测IgM型抗体的方法。将抗人IgM抗体包被于固相载体表面，与标本中所有人IgM抗体结合，洗涤后加入特异性抗原与相应的特异性IgM抗体结合，洗涤后再加入酶标的抗原特异性抗体与之结合，洗涤后加入底物显色。1.加样2.孵育3.洗涤4.加入抗原孵育5.加入二抗孵育6.显色捕获法ELISAELISA试剂的组成固相载体：许多物质可以作为固相载体，如纤维素、聚丙烯、聚乙烯、聚氯乙稀和聚苯乙烯等等。目前最为常用的是聚苯乙烯材质的微孔板，多为8×12道96孔板条。吸附能力通透性均一性酶标记物：酶与抗体的共价结合首先不影响酶及抗体的活性、不产生干扰物质、不产生非特异反应。辣根过氧化物酶（HorseRadishPeroxidase，简称HRP）是目前应用最为广泛的酶，是从辣根菜的根中提取。碱性磷酸酶（AlkalinePhosphatase，简称AP）是从小牛肠粘膜中提取。活性高，但提取工艺复杂，价格比较昂贵。底物：不同种类的酶要求使用不同的底物。HRP——邻苯二胺（Orthopenylenediamine，OPD）、四甲基联苯胺（Tetramethylbenzidine，TMB）和ABTS『2,2‘-连氮-双-(3-乙基苯并噻唑啉磺酸)』，OPD为在ELISA中应用最多的底物，灵敏度高，比色方便，作用后变橙红色，其缺点是配成应用液后稳定性差。TMB经酶作用后由无色变蓝色，目测对比鲜明，加酸停止酶反应后变黄色。AP——对硝基苯磷酸酯（p-nitrophenylphosphate，p-NPP）作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在405nm有吸收峰。用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一段时间。洗涤液：聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附作用是普遍性的，因此在ELISA在洗涤时应非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。洗涤是最主要的关键技术，应引起操作者的高度重视，应严格按要求洗涤。洗涤液多为含非离子型洗涤剂的中性缓冲液，一般是吐温20（聚山梨酯）。洗板时注意不同试剂盒的洗液不要混用。标本稀释液：用来稀释血清标本，有时也稀释酶结合物。RF吸附剂：在进行IgM抗体检测时，间接ELISA方法需要使用RF吸附剂去除类风湿因子的干扰作用。ELISA的质量控制及注意事项ELISA质量控制的目的获得正确的检验结果。使不同时间和地点的ELISA检验结果具有可比较性。ELISA准确度的影响因素—患病率在检测真正感染疾病患者中，检测的准确度随着该传染病在人群中的患病率的变化而改变。患病率越高，被检测者阳性是真阳性的可能性就越大。患病率和阳性预测值(PPV)的关系患病率高低被检测数量1000010000总阳性数100030假阳性数量2727真阳性数量9733阳性预测值（PPV）97.3%10%PPV=患病率×灵敏度/[患病率×灵敏度+(1-患病率)×(1-特异性)]×100%解决方法试剂1试剂2试剂1+2敏感度特异度99.0%99.0%99.5%99.9%(串联)患病率PPVPPVPPV0.2%28.4%66.4%99.75%2.0%80.2%80.2%99.97%20.0%98.0%99.6%99.99%ELISA准确度的影响因素—实验过程实验操作人员的教育背景和培训标本的条件试验过程中的对照试剂设备结果的解释结果的抄写和报告ELISA实验过程中涉及的质量控制—仪器移液器，ELISA的加样量小，选择量程合适的加样枪，其准确性直接影响试验结果。定期进行校准。水浴锅，有外部温度计对仪器温度进行校准。洗板机，残留液体不能使拍干的纸变湿，定期检查加液孔有无堵塞。酶标仪，定期检查。ELISA的标本最为常见的是血清（浆），有时因为特定的检测目的，用到唾液、脑脊液、尿液等标本。1.要注意避免出现严重溶血。血红蛋白中含有血红素基团，其有类似过氧化物的活性，因此，在以HRP为标记酶的ELISA测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，则其就很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的HRP底物反应显色。2.样本的采集及血清分离中要注意尽量避免细菌污染，一则细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用；二则一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。ELISA实验过程中涉及的质量控制—标本3.血清标本如是以无菌操作分离，则可以在2～8℃下保存一周，如为有菌操作，则建议冰冻保存。样本的长时间保存，应在-70℃以下。4.冻存的血清标本须注意避免因停电等造成的反复冻融。标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。此外，冻融标本的混匀亦应注意，不要进行剧烈振荡，反复颠倒混匀即可。5.标本在保存中如出现细菌污染所致的混浊或絮状物时，应离心沉淀后取上清检测。标准操作规程（SOP）实验纪录日期操作人员试剂批号试剂有效期试剂准备，使用前在室温平衡20min以上，以便在温育时很快达到反应要求温度，避免弱阳性标本产生假阴性结果。水浴ELISA实验过程中涉及的质量控制—其它试剂盒的阴性和阳性对照在控制范围内ELISA板的空白对照OD值在控制范围内实验室内部质控血清(In-HouseControl,IHC)每次试验都要包括一个实验室质控血清。可以监测标本处理过程，而试剂质控只能监测之后的过程。确保每次试验操作的正确性和结果的一致性。尤其是可以监测试剂不同批号之间的差异。可以做质控图。ELISA实验过程中涉及的质量控制—内部质控（IQC）包括试剂质控和内部质控血清收集新鲜的无溶血、无黄疸、无细菌污染的阳性血清，56℃加热30min灭活。用0.45um滤器过滤除去污染物和杂质，用阴性血清、正常人血清或PBS缓冲液将收集的血清进行一系列稀释。检测稀释标本并绘制s形标准曲线。选择Cutoff值1.5至3倍OD值所对应的稀释度，作为IHC。一次准备12个月使用量，分装到血清管，每管30ul，于-20℃保存备用。内部质控血清（IHC）的制备如何用内部质控血清（IHC）做质控图在常规试验条件下，将IHC放在常规样本中，进行20次检测，计算均值和标准差（SD）。并绘制质控图。2SD是一般公认的允许误差限度。每批测定放一份质控血清时：一次超过2SD但小于3SD作为“告警”一次超出3SD、连续二次超出2SD、3-5次连续处于一侧的2SD之内、5～7次连续偏向横轴的一侧，均为失控同一批号试剂和质控血清。举例：质控图“即刻性”质控只需连续测3次，即可对第3次检验结果进行质控。即刻法的建立具体计算方法如下：1)先将测定值从小到大排列2)计算X和SD。3)计算SDI上限和SDI下限值。4)将SDI上限、SDI下限值与SDI值中的数字比较。当SDI上限值和SDI下限值＜n2SD时，表示处于控制范围内，可以继续往下测定，继续重复以上各项计算；当SDI上限和SDI下限有一值处于n2SD和n2SD值之间时，说明该值在2SD~3SD范围，处于“告警”状态；当SDI上限和SDI下限有一值＞n3SD时，说明该值已在3SD范围之外，属“失控”。数值处于“告警”和“失控”状态应舍去，重新测定。Nn3sn2snn3sn2s31.151.15122.552.2941.491.46132.612.3351.751.67142.662.3761.941.82152.702.4172.101.94162.752.4482.222.03172.792.4792.322.11182.822.50102.412.18192.852.53112.482.23202.882.56SI值表ELISA实验过程中涉及的质量控制—外部质控ELISA试验中的外部质控(EQA)用于连续地、客观地评价不同实验室之间的检测结果，并发现室内质控不易发现的不准确性，了解各实验室之间结果的差异，并帮助校正，使具有可比性。主要控制试验结果的准确度。发放质控血清（组合血清）进行调查（PT）。定期发放质控血清至各实验室，各实验室在规定的日期进行检验，并将检验结果上报。由上级实验室定期对下级的检测结果进行复核。现场调查，携带质控血清到实验室进行现场操作，并对结果进行评价。