第三章--蛋白质的共价结构

第三章蛋白质的共价结构一、蛋白质通论（一）、蛋白质的化学组成碳50%氢7%氧23%氮16%硫0-3%其它微量元素（包括磷，金属元素等，这些是蛋白质的辅助成份或修饰成份）在这些化学元素中，氮的含量在不同蛋白质中很稳定，所以可以根据氮元素的含量测定蛋白质的含量：蛋白质含量＝蛋白质氮×6.25这是蛋白质定量分析的理论基础，经典的蛋白质含量测定方法就是先测定蛋白质氮的含量，再根据上述公式计算蛋白质的含量。（二）、蛋白质的分类（三）、蛋白质的形状和大小蛋白质的大小与分子量蛋白质的分子量变化较大，从6000到1,000,000道尔顿（dolton）。蛋白质的分子量可以通过实验予以测定，通常也可根据氨基酸的数目估计：蛋白质的分子量（dolton）＝氨基酸残基数×110但对于结合蛋白上述公式不适应。蛋白质的结构层次一级结构：氨基酸序列二级结构：α螺旋，β折叠三级结构：所有原子空间位置四级结构：蛋白质多聚体1969年正式将一级结构定义为氨基酸序列和双硫键的位置。介于二级结构和三级结构之间还存在超二级结构（二级结构的组合）和结构域（在空间上相对独立）这两个层次。(五）蛋白质的功能1.酶2.结构成分3.氨基酸的贮藏4.运输功能5.运动6.激素7.免疫8.信息传递9.基因表达调控二、肽由氨基酸聚合而成的线性结构叫肽链（peptidechain)，蛋白质就是由一条或多条肽链组成。蛋白质的共价结构也即是肽链的结构。蛋白质的共价结构有时也称一级结构。但根据IUPAC的规定蛋白质的一级结构指肽链的氨基酸顺序。（一）、肽和肽键的结构1.蛋白质是由氨基酸通过肽键连接起来的多肽链分子，肽键是它的连接方式。蛋白质一级结构中的另一种共价结构是二硫键。它使同一条链内或两条链间的两个巯基形成二硫键。2.肽键的结构3.有关肽的名称多肽，环肽，阅读方向，氨基酸残基4.肽键的性质刚性，反式肽键将氨基酸与氨基酸头尾相连残基：在肽链中每个氨基酸都脱去一个水分子，脱水后的残余部分叫残基（residue),因此蛋白质肽链中的氨基酸统统是残基形式。（二）肽的物理与化学性质1.带电性短肽：酸碱性由末端的α—氨基和α—羧基和R基团的可解离基团决定，滴定曲线相似于氨基酸的滴定曲线。其中α—氨基的pK值较游离氨基酸小，α—羧基的pK值较游离羧基大，R-基团变化不大。长肽或蛋白质中酸碱性由R-基团决定。电荷计算：根据R基团在某一pH值时的解离状态确定；等电点计算：同样，先写解离式，再根据pK值进行计算。2.化学性质α—氨基，α—羧基和R基团与游离氨基酸一样，同样有茚三酮反应，还有肽键特有的反应——双缩尿反应。3.旋光性短肽为各氨基酸的旋光度的综和，而长肽不等于其总和。(三）、天然肽有许多种生物活性：激素，抗生素等。肽激素，α—鹅膏蕈碱，谷胱甘肽。三、蛋白质一级结构测定(一)、氨基酸序列分析的基本策略———重叠法(二)、蛋白质一级结构测定的步骤1、蛋白质的分离纯化2、测定多肽链的数目3、(亚基分离）4、二硫键的拆分与保护5、氨基酸组成分析6、鉴定N-或C-末端残基7、多种方法的部分水解和肽段分离8、测序9、重叠10、确定二硫键的位置1.N-末端测定（1）二硝基氟苯（DNFBorFDNB)法；（2）丹黄酰氯（DNS)法;（3）苯异硫氰酸酯（PITC)法；（4）氨肽酶（aminopeptidase)法2.C-末端测定（1）肼解法（hydrazinolysis)法；（2）还原法（reduction);（3）羧肽酶（Cardoxypeptidase)法3.二硫键的切割与保护1、过甲酸〔performicacid〕不可逆－CH2SO3H2、亚硫酸分解〔Sulfitolysis〕可逆－R1-S-S-R2＋SO3-R1-S-+R2-S-SO33、还原＋氧化不可逆[巯基乙醇，DTT]＋碘乙酸等－S-CH2-COOH4.氨基酸组成分析1.酸水解；2.碱水解；3.氨基酸分析5.肽键的专一性水解酶水解化学法:BrCN，NH2OH酶法水解6.N末端和C末端测序法N末端：1、Sanger法DNFB2、Edman法3、Dansylchloride/Edman组合法4、酶降解法C末端：1、肼法2、3H标记法3、酶降解法4、PFPA/PFPAA法C末端的肼(hydrazine)法测定C端的氚[3H]标记法测定酶解法末端测序利用外切蛋白水解酶(exo-peptidase)将肽链的氨基酸从N端(aminopeptidase)或C端(carboxypeptidase)一个接一个游离出来，在不同时间取样进行分析，根据所游离的氨基酸的摩尔数的多少来判断氨基酸的排列顺序。PFPA和PFPAA法C端测序PFPA：pentafluoropropionicacidC2F5COOHPFPAA：PentafluoropropionicacidanhydrideC2F5-COOOC-C2F5这两种物质在酸性条件下低温反应，可以从C端一个接一个地切除氨基酸，与质谱相结合就可以确定C端多个氨基酸的序列。7.肽段氨基酸序列的测定Edman降解法氨基酸的鉴定、分离纯化Edman降解与DNS-Cl法的结合其它方法：1.酶解法2.质谱法3.根据核苷酸序列推断质谱法Edman循环后看分子量的变化7.二硫键位置的确定法1、为防止Cys跟Cys-Cys发生交换反应，先将自由SH基封闭。2、进行专一性部分水解3、纸层析分离水解产物4、气相过甲酸法切断S-S键，作第二相纸层析5、将迁移率发生变化的多肽进行测序N末端和C末端的测序除了用于未知蛋白质的一级结构的研究以外，最常用于基因工程表达产物的末端分析。四、蛋白质氨基酸序列与生物学功能的关系（一）同源蛋白质的物种差异与生物进化1.蛋白质的同源性（sequencehomology)2.不变残基（invariantresidue)3.可变残基（varibleresidue)（二）同源蛋白质的起源共同性（三）蛋白质断裂与激活第三章蛋白质的三维结构蛋白质的一级结构不具有功能，只有形成正确的结构才具有功能。二级结构以上的结构叫高级结构，由于高级结构是指各原子或基团在空间上的分布，所以又叫空间结构，或三维结构。一、蛋白质的二级结构（一）维持蛋白质空间构象的作用力作用力破坏因子氢键：α-螺旋，β-折叠尿素，盐酸胍疏水作用：形成球蛋白的核心去垢剂，有机溶剂VanderWaals力：稳定紧密堆积的集团和原子离子键：稳定α-螺旋，三、四级结构酸、碱二硫键：稳定三、四级结构还原剂配位键：与金属离子的结合螯合剂EDTA（二）影响蛋白折叠的因素1.二面角的转动2.非键合原子之间的最小接触距离3.侧链基团的空间位阻、电荷性质、基团间的相互作用等二、典型的二级结构1.α螺旋右旋，3.6个氨基酸一个周期，螺距0.54nm第n个AA(NH)与第n-4个AA(CO)形成氢键，环内原子数13。氢键取向与主轴基本平行1.α-螺旋的结构特征：Φ=-57o;ψ=-47o;3.613-螺旋螺距=5.4Å；每个氨基酸上升1.5Å,直径=5Å2.α-螺旋的偶极矩和帽化3.α-螺旋的手性α-螺旋都是右手的，其旋光性是α-碳原子的不对称性与α-螺旋的构象不对称性的结合。4.影响α-螺旋的形成的因素：pH的影响一级结构与二级结构的关系（空间位阻，电荷效应，特殊结构，如脯氨酸）。2.β折叠β—折叠旋的结构特征：Φ=—139o;ψ=＋135o（反平行折叠）主要存在于球状蛋白和纤维蛋白中Φ=—119o;ψ=＋113o（平行折叠）主要存在于球状蛋白β—折叠较为伸展。3.β转角－－半圈3.010螺旋β-凸起4、无规卷曲（randoncoil)指那些没有明确重复周期结构的“卷曲结构”，它并非是“无规”卷曲，而是有序的非重复结构。这些无规卷曲结构常常构成蛋白质的活性结构部位和特异功能部位。三、纤维状蛋白功能：动物支架蛋白，占一半或一半以上。分子轴比大于10,分类：不可溶和可溶两种：前者包括角蛋白，胶原蛋白，后者包括肌球蛋白和纤维蛋白原。注意，有的象纤维状的蛋白是球状蛋白的长轴方向的聚集体不是纤维蛋白。α-角蛋白•存在•分类•结构•特性:伸缩性——螺旋圈间的氢键刚性——链间二硫键（含硫量）β-角蛋白存在结构：反平行β-折叠片，多肽链呈锯齿状折叠构象，侧链交替的分布在折叠片两侧；主要由具有Gly、Ser、Ala组成。作用力：链间以氢键连接层间以范德华力维系特性:抗张性柔软性不能拉伸（二）胶原蛋白Collagen的特殊性胶原蛋白的要点：1.胶原的组织分布和类型2.胶原的氨基酸组成3.胶原蛋白的结构4.稳定胶原蛋白结构的作用力稳定胶原三股螺旋的作用力：•层间的范德华作用力；•螺旋链间氢键；•链间的共价交联•赖氨酸间的交联•吡啶啉结构。（三）弹性蛋白（四）肌球蛋白四、蛋白质的超二级结构超二级结构的类型αα：keratin,myosin,βαβ、βββ：拥有β-sheet的蛋白质形成超二级结构的作用力αα：α螺旋的侧链位置的20度错位βαβ：伸展肽链的12.5度自然扭曲六、蛋白质的结构域结构域(domain)在空间上相对独立七、球状蛋白质三级结构（一）球状蛋白的分类（二）球状蛋白三维结构的特征1.球状蛋白分子含有多种二级结构元件2.球状蛋白具有明显的折叠层次3.球状蛋白分子为紧密的球状或椭球状实体4.球状蛋白疏水侧链埋藏在分子内部，亲水侧链暴露在分子的表面5.球状分子的表面有沟穴。八、膜蛋白的结构（一）生物膜的结构（二）膜内在蛋白的结构1.单跨膜肽段的膜蛋白2.具有7个跨膜肽段的膜蛋白3.β—桶型膜蛋白——膜孔蛋白（三）脂锚定蛋白九、蛋白折叠和结构预测（一）蛋白质的变性蛋白质的变性是指蛋白质空间结构发生改变，活性丧失的现象。变性不是降解（分解）1.变性的表现：（1）活性丧失；（2）一些侧链基团的暴露，侧链基团的化学反应特性发生改变；（3）理化性质发生改变；（4）生化性质发生改变。2、引起变性的因素（1）物理因素：光、热、射线、高压、表面张力等；（2）化学因素：变性剂，去污剂，重金属等。3、变性的本质变性是蛋白质分子高级结构的变化，主要是三级结构，二级结构的改变。蛋白质分子的结构是一个柔性、动态的结构，这种动态的结构在活性范围内变化，不会引起活性的变化，而超过允许的范围，次级键发生改变，蛋白就变性。4.蛋白质变性的可逆性蛋白质变性后，消除变性因素后，蛋白质可恢复其活性的变性叫可逆变性。蛋白质变性后，消除变性因素后，蛋白质不能恢复其活性的变性叫不可逆变性。二、一级结构对高级结构的规定性蛋白质的一级结构决定高级结构结论：蛋白质的一级结构决定其高级结构。换言之，蛋白质的三维立体结构完全取决于其氨基酸的序列。蛋白质的天然立体结构一般是自由能最低的状态。（三）、蛋白质的折叠1.蛋白折叠研究的现状：多数是采用体外变性/复性过程研究折叠过程，而这种过程与体内过程是不一样的。所以这一研究方法本身存在缺陷。2.异构酶和分子伴侣在体内蛋白质折叠中的作用在一部分蛋白质中，其正确的空间结构的形成需要一些辅助蛋白的作用，这些辅助蛋白即是异构酶和分子伴侣。蛋白二硫键异构酶（proteindisulfideisomersePDI)，其作用是加速二硫键的形成；肽基脯氨酸异构酶（peptidylprolylisomerse),其作用是帮助脯氨酸的顺—反异构过程。分子伴侣（molecularchaperone)的作用是帮助肽链的正确折叠。（四）蛋白质结构预测1.二级结构预测2.三级结构的预测（1）同源蛋白质结构预测（2）能量最小原则预测（3）“局部”和“分层”方法—LINUS预测方法结构预测的意义：对于新的功能基因的研究，通过结构预测，推断其可能的功能，为进一步开展其功能研究奠定基础。十、亚基的缔合和四级结构（一）名称：1.四级结构：多个亚基缔合形成聚集体即四级结构；2.亚基（单体monomer)：一条多肽链形成的球状蛋白结构；3.原(聚)体（protomer)：对称的寡聚蛋白质分子是由两个或多个不对称的等同结构组成,这种等同结构成分称为原体;4.寡聚体：两个以上的亚基组成的蛋白质；5.同多聚体(homomultimeric)