我国重要食源性寄生虫病的发病机制及防治研究

项目名称：我国重要食源性寄生虫病的发病机制及防治研究首席科学家：余新炳中山大学起止年限：2010年1月-2014年8月依托部门：教育部一、研究内容弓形虫、旋毛虫、广州管圆线虫和华支睾吸虫是我国重要的食源性寄生虫，对我国食品安全及国民健康构成严重威胁。食源性寄生虫与宿主相互作用所致的组织炎症和免疫病理损伤是上述4种寄生虫病的共同病变结局。因此，寄生虫与宿主相互作用的分子基础及其免疫调节机制是关键科学问题。本项目围绕这一科学问题，针对上述4种食源性寄生虫病，从环境、遗传和分子生物学层面，从基因、蛋白、细胞、整体、机制和功能等诸方面有机地整合在一起进行系统研究，从筛选食源性寄生虫诱发宿主炎症和免疫病理损伤相关的基因或蛋白入手，通过对基因表达蛋白相关功能的研究及体内外验证，确认这些寄生虫关键致病分子和免疫调节分子，并研究这些虫体关键分子与宿主的相互作用，阐明弓形虫、广州管圆线虫、旋毛虫和华支睾吸虫的致病机制和免疫调节机制，在此基础上研究新的干预措施，为这些重要食源性寄生虫病防治提供新思路和新方法。主要研究内容：1、寄生虫的致病关键基因或蛋白分子及其功能研究：对4种食源性寄生虫分别从下述的三个层面研究其致病关键基因或蛋白:①利用寄生虫的分子标记，分析从我国不同地区分离的寄生虫虫株，通过研究虫株的基因型与致病的关系，确定流行我国寄生虫虫株的致病基因型；②利用生物信息学技术，从寄生虫基因文库中筛选与疾病相关的潜在功能基因并进行重组表达，在体内外研究其与致病的关系，确定致病相关基因；③富集体外培养的寄生虫分泌排泄蛋白或其中的蛋白酶组分，利用基于生物质谱的蛋白质组学技术鉴定，选择并重组表达其中的相关功能蛋白，在体内外研究其与致病的关系，确定致病相关蛋白。2、虫体致病相关蛋白与宿主靶蛋白的相互作用研究①利用本课题已有的高覆盖率的人类蛋白质组芯片（含17000多种人类蛋白质），寻找能与虫体致病蛋白相互作用的宿主靶蛋白，在体内外研究虫体致病蛋白与宿主靶蛋白的相互作用，从中发现与宿主免疫相关的虫体致病蛋白，并研究其免疫相关功能；②利用小分子抑制剂、转基因或基因沉默技术，干扰虫体致病蛋白的功能，研究干扰后寄生虫虫体与宿主的相互作用。3、寄生虫致病机制及防治干预研究：①利用免疫磁珠分选法和流式细胞检测技术，检测动物感染后外周血液中抗原递呈细胞、效应细胞及调节性Ｔ细胞的数量变化，以及炎症细胞因子的表达水平，比较寄生虫感染过程中适宜和非适宜宿主细胞免疫应答与炎症发生的关系；通过细胞或动物感染模型，研究干预免疫细胞的活化及其相关信号通路，对寄生虫感染所致的炎症反应的影响。②利用细胞和动物模型，通过检测端粒酶活性、BMI1、P53、细胞周期控制相关蛋白基因表达水平等与细胞永生化及恶性转化的指标，并通过肿瘤细胞克隆形成实验和祼鼠体内成瘤实验，研究虫体致病蛋白对宿主靶细胞的永生化及恶性转化的作用。③利用转基因或基因沉默技术，构建致病蛋白缺陷型虫株，研究其对宿主的致病作用的影响；或利用小分子化合物干预致病蛋白活性，研究寄生虫病防治的新策略和新方法。二、预期目标总体目标本项目研究围绕“食源性寄生虫与宿主相互作用的分子基础及其免疫调节机制”这一科学问题，针对弓形虫病、旋毛虫病、广州管圆线虫病和华支睾吸虫病4种食源性寄生虫病，从环境、遗传和分子生物学层面，从基因、蛋白、细胞、整体、机制和功能等方面有机整合在一起进行系统研究。通过发现并验证致病相关基因和关键蛋白，研究这些致病分子在诱导炎症、免疫病理和免疫调节方面的功能，揭示这些重要靶分子在食源性寄生虫病的发生、发展中的作用。同时，利用细胞模型和动物感染模型，并结合干预研究，从分子病理学和分子免疫学水平研究这些致病分子与宿主相互作用的分子机制，阐明这些重要寄生虫病的致病机理，寻找新的防治策略和方法，提高早期诊断、早期干预及治疗水平，保障食品安全，降低感染率、发病率和死亡率。使我国寄生虫病基础研究和防治达到国际领先水平。五年预期目标1.建立我国人兽弓形虫分离株的基因型库，明确流行我国弓形虫虫株的主要基因型，及其与毒力和致病的相关性，通过比较蛋白质组学技术分析不同基因型虫株速殖子和缓殖子基因表达差异，研究差异蛋白的功能，阐明弓形虫速殖子和缓殖子相互转换的分子机制并发现药物作用的新靶点，采用高通量人蛋白质组芯片，研究致病相关基因型虫体入侵与宿主细胞之间相互作用的分子关系，为致病基因型虫株在妊娠结局的转归评估及艾滋病等免疫低下患者的早期干预方案的制定提供科学依据。2.对旋毛虫引起的食源性寄生虫病，通过发现并验证旋毛虫致病相关基因和关键分泌蛋白，研究这些致病分子在虫体入侵肠上皮细胞和成囊过程的致病相关功能，揭示其在旋毛虫病的发生发展中的作用。同时，利用细胞模型和动物感染模型，并结合干预研究，从分子病理学和分子免疫学水平研究虫体致病分子与宿主相互作用的分子机制，阐明旋毛虫病的致病机理，在此基础上寻找新的防治策略和方法，提高旋毛虫病早期诊断、早期干预及治疗水平，保障肉类食品安全，降低旋毛虫病感染率、发病率和死亡率。3.通过华支睾吸虫分泌排泄抗原中对胆管上皮细胞、卵圆细胞、肝星状细胞的活化和转化效应的关键分子的发现及其相关功能研究，试图阐明华支睾吸虫感染引起胆管上皮细胞增生和肝纤维化的形成机制；并通过研究这些关键分子对胆管上皮细胞永生化和恶性转化的效应，揭示华支睾吸虫感染诱发肝胆管癌的分子基础；通过干预研究，明确控制幼虫成囊的关键分子及其作用，为阻断华支睾吸虫病传播途径提供新的免疫预防策略。4.发现广州管圆线虫活化淋巴细胞和嗜酸性粒细胞等免疫细胞的关键虫源分子，探讨其介导的炎症反应信号转导通路，研究广州管圆线虫感染后宿主炎症细胞活化及细胞因子释放网络，进一步阐明广州管圆线虫感染所致的中枢神经系统炎症反应的免疫调节机制，提出治疗广州管圆线虫感染所致炎症损伤的新思路。优秀人才培养和量化考核指标优秀人才培养：以课题承担单位为人才培养基地，充分利用中山大学“有害生物防治和资源利用国家重点实验室”、“热带病防治研究教育部重点实验室”的平台实力，培养具有国际竞争力的优秀人才；预期培养国家教育部“长江学者奖励计划”岗位或讲座教授1-2名、国家杰出青年基金获得者2-3名。培养博士后50-60名、博士生100-120名、硕士生120-150名。量化考核指标：通过本项目的研究，取得一批在国内外具有影响力的研究成果，包括在SCI学术期刊发表论文100-120篇，其中在本专业领域影响力排前五位的学术期刊发表论文数达40％以上，项目内容被国际学术会议邀请作大会报告达5次以上。国家发明专利、实用新型专利受理或授权10项左右。三、研究方案总体研究思路寄生虫与宿主相互作用所致的炎症和免疫病理损伤是弓形虫病、旋毛虫病、华支睾吸虫病、广州管圆线虫病4种食源性寄生虫病的共同病变结局。因此，本项目研究围绕“食源性寄生虫与宿主相互作用的分子基础及其免疫调节机制”这一科学问题，从环境、遗传和分子生物学层面，从基因、蛋白、细胞、整体、机制和功能等方面有机整合在一起进行系统研究。通过发现并验证致病相关基因和关键蛋白，研究这些致病分子在诱导炎症、免疫病理和免疫调节方面的功能，揭示这些重要靶分子在食源性寄生虫病的发生、发展中的作用。同时，利用细胞模型和动物感染模型，并结合干预研究，从现代病理学和分子免疫学水平研究这些致病分子与宿主相互作用的分子机制，阐明这些重要寄生虫病的致病机理，研究新的防治策略和方法，以期提高早期诊断、早期干预及治疗水平，保障食品安全，提高国民健康水平。创新性本项目围绕“食源性寄生虫与宿主相互作用的分子基础及其免疫调节机制”这一科学问题，以人蛋白质组芯片、蛋白质组学技术、流式细胞检测等高通量技术及分子免疫学和现代病理学技术为主要技术手段，从基因、细胞、整体、机制和功能等方面有机整合在一起进行系统研究。其创新性主要表现为：1.本项目凝练出“寄生虫与宿主相互作用的分子基础及其免疫调控机制”这一科学问题，并以寄生虫与宿主相互作用所致炎症和病理损伤作为研究弓形虫病、旋毛虫病、华支睾吸虫病和广州管圆线虫病4种食源性寄生虫病共同的核心内容。2.本项目以寄生虫致病蛋白与相应的宿主靶蛋白的相互作用作为研究寄生虫与宿主关系和致病-免疫机制的切入点，并首次利用目前世界上蛋白质种类覆盖率最全的人蛋白质组芯片，筛选与寄生虫致病蛋白相互作用的宿主靶蛋白，不仅大大提高了筛选人靶蛋白的机率，而且研究结果能直接反映出寄生虫与人相互作用的分子关系。3.基于研究寄生虫致病分子和宿主靶分子的相互关系及致病机制的结果，提出干预食源性寄生虫病的新策略和新方法。总体研究技术路线从感染的人和动物分离弓形虫虫株体外培养弓形虫、旋毛虫、华支睾吸虫、广州管圆线虫富集分泌排泄物确定虫株基因型质谱-蛋白质组学鉴定分泌蛋白确定致病相关基因重组表达分泌蛋白人蛋白质组芯片确定毒力基因型虫株重组表达相应蛋白人蛋白质组芯片虫体蛋白与宿主靶蛋白介导的虫体-宿主相互作用研究转基因、基因沉默或小分子抑制剂速殖子和缓殖子转换致致病机制和防治干预研究发发现分泌蛋白作用的宿主靶蛋白可行性分析1.人员结构合理:本研究团队汇集了在食源性寄生虫学、医学生化与分子生物学、蛋白质组学、神经生物学、免疫学、药物化学等领域长期从事基础研究的优秀科研人员，大部分骨干成员有长期合作的基础，完全胜任本项目拟定的科研计划。2.研究平台优越:拥有“有害生物防治与资源利用国家重点实验室(中山大学)”、“热带病防治研究教育部重点实验室(中山大学)”、“重要遗传病基因资源利用教育部重点实验室(安徽医科大学)”，本项目5个承担单位均拥有“生物安全二级实验室”，同时还拥有国家认证认可的“生物安全三级实验室（中山大学）”。3.资源充足:建立了完善的华支睾吸虫和广州管圆线虫的人工生态系统,拥有科技部重要寄生虫虫种种质资源库，有丰富的食源性寄生虫资源：包括6个国内人源性弓形虫虫株和多个国外引进的弓形虫虫株（ME49株,RH株,Pru虫株,GFP标记的和Luciferase标记的RH虫株等）。4.项目管理合理:以中山大学为总协调单位,团队合作联合攻关,具有完善合理的项目监督管理机制,保证专款专用和项目的顺利完成。课题设置：综合分析国内外最新研究进展和发展趋势，结合我们已有的研究基础，设置4个课题：①流行我国弓形虫虫株的毒力基因型及其致病机制研究；②旋毛虫致病的分子基础及干预研究；③华支睾吸虫致病的基础研究；④广州管圆线虫病的免疫调节机制研究。课题一、流行我国弓形虫虫株的毒力基因型及其致病机制研究主要研究内容：①根据2005年卫生部公布的第二次全国人体寄生虫病流行状况调查数据，从我国弓形虫感染率高、中、低三类流行区的散养鸡、猫（弓形虫终末宿主）、弓形虫抗体阳性而中止妊娠流产胎儿及免疫力低下人群中分离弓形虫虫株；②根据国际公认的弓形虫基因分型标志(c22-8、c29-2、L358、PK1b、SAG2、BTUB、GRA6、SAG3、Apico等)，对获取的弓形虫虫株进行基因分型，确定流行我国弓形虫虫株的主要基因型；③根据感染小鼠的致病和死亡情况以及孕鼠致畸实验，确定各基因型株的毒力。将这些毒力株与孕妇流产、新生儿致畸及艾滋病等免疫低下患者中分离的弓形虫虫株进行基因型比较，研究流行我国弓形虫虫株基因型与毒力和致病的相关性；④利用弓形虫基因芯片、蛋白质组技术，比较分析不同致病基因型虫株速殖子和缓殖子基因表达差异，识别速殖子和缓殖子转换的调控关键基因或特有的蛋白质，并通过基因敲除等技术验证其对转换的作用，研究速殖子和缓殖子转换的分子基础及药物作用的新靶点；⑤利用弓形虫感染小鼠模型，研究在免疫抑制剂作用下，致病基因型虫株缓殖子向速殖子转换与宿主免疫细胞及细胞因子的关系；利用免疫低下或免疫缺陷小鼠感染模型，研究在免疫重建后，致病基因型虫株速殖子向缓殖子转换与宿主免疫细胞及细胞因子的关系，明确致病基因型虫株速殖子和缓殖子相互转化的关键宿主免疫分子，毒力相关虫源性分子与宿主免疫细胞的相互调节机制和相关信号通路。研究目标：建立我国人兽弓形虫分离株的基因型库，明确流行我国弓形虫虫株的主要基因型，及其