动物干细胞培养

第十五章动物干细胞技术2011.5主要内容序言干细胞的定义、分类、定位干细胞的生物学及形态学特征干细胞的分离纯化和培养干细胞研究意义干细胞的应用前景干细胞研究中存在的问题序言干细胞(stemcells,SC)：是一类具有无限增殖和自我修复能力(self-renewing)的多潜能细胞，也称为“万能细胞”。1999年，Science评价：世界十大科技进展魁首2000年，Science评价：世界十大科技进展之一2002年，Science评价：值得关注的六大科技领域之一2007年，Science评价：IPS(万能细胞)动物干细胞技术指通过各种方法获得干细胞，经体外培养建立细胞系，并对其进行定向分化诱导研究，以期获得需要的某一特定类型细胞。干细胞研究历史始于19世纪，至今已有1个世纪。1896年，Wilson在一篇论述细胞生物学的文献中，首次使用“干细胞”这一概念，专门用于描述寄生虫生殖系的祖细胞。1981年，Evans和Kaufman用延迟胚胎着床的方法分离胚胎内细胞团，首次成功分离得到小鼠胚胎干细胞。2007年，科学家将成年小鼠体细胞诱导逆转成干细胞，更加为干细胞技术研究提供了新的思路。干细胞研究意义(1)干细胞通过核移植或胚胎嵌合，能得到克隆动物，这对提高优良家畜的繁育效率及拯救濒危动物具有重要意义。(2)由于可以对干细胞进行体外遗传操作、选择和冻存而不失其多能性，所以在特定条件下可诱导分化为人们所需要的细胞、组织和器官等并用于临床治疗。(3)干细胞技术在生物学基础研究、农业以及移植医学上具有广阔的应用前景，其研究成果必将引起人类临床医学的一场革命。1、干细胞的定义、分类、定位1.1定义干细胞(stemcells,SC)：是一类具有无限增殖和自我修复能力(self-renewing)的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，存在于个体的不同阶段以及成体的不同组织中。基本特征：自我修复多向分化潜能干细胞的分化及自我更新1.2分类：1.2.1根据细胞分化潜能的大小分为全能干细胞(totipotentstemcells)三胚层多能干细胞(pluripotentstemcells)单胚层多能干细胞(multipotentstemcells)单能干细胞(monopotentstemcells)全能干细胞：单个细胞如能发育成一个完整的个体，就称该细胞的这种潜能为全能性。三胚层多能干细胞：指细胞失去了发育成完整个体的能力，但仍具有分化成个体中各种细胞的潜能。单胚层多能干细胞：只能分化成几种特定类型的细胞，如间充质干细胞通常只能分化成骨、肌肉、软骨、脂肪及其他结缔组织，而不能分化为除此之外的其他组织。单能干细胞：只能分化为一种细胞，如成体干细胞中的神经干细胞，只能分化为神经元，而不能分化为显形胶原或少突胶原，这种细胞称为单能干细胞。人受精卵着床前胚胎发育过程小鼠精卵着床前胚胎发育过程桑葚胚（全能干细胞）1.2.2根据细胞来源不同分为胚胎性干细胞(embryonicstemcell，ES细胞)成体干细胞(adultstemcells)（1）胚胎性干细胞ES细胞：指源于囊胚内细胞团(innercellmass，ICM)的胚胎干细胞(embryonicstemcells,ES)。EC细胞：从畸胎瘤中分离得到的多能性细胞(embryoniccarcinormacells，EC)。EG细胞：胚胎生殖细胞，从早期胎儿原始生殖细胞(primordialgermcells，PGCs)中分离到的细胞(embryonicgermcells,EG）。均属三胚层干细胞。胚泡（三胚层多能干细胞）从ICM分离和培养后得到典型的小鼠胚胎干细胞集落（箭头所示），周围分散有上皮样细胞。标尺长度=200μm,（引自KursadTurksen《EmbryonicStemCellProtocols》（2nd）,2006）ES细胞Embryonicstemcell（2）成体干细胞定义：成体干细胞是指一些具有组织特异性的细胞，它们主要用于维持细胞功能的稳定，具有修复和再生能力，能够产生新的干细胞，或者能按一定的程序分化，形成新的功能细胞，使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。成体干细胞分类：造血干细胞：存在于骨髓、外周血和脐带血中，用于治疗血液系统疾病以及多种实体肿瘤。神经干细胞：存在于中枢神经系统，进一步分化成中枢神经系统的某些细胞类型。间充质干细胞：存在于全身结缔组织和器官间质中，由于它具有向骨、软骨、脂肪、肌肉及肌腱等组织分化的潜能，因而利用它进行组织工程学研究。表皮干细胞：位于表皮基底层，具强大的增殖分化潜能，在体外可以分化成表皮全层细胞。表皮干细胞作为组织工程皮肤的种子细胞，已经在治疗烧伤方面发挥作用。外周血（peripheralblood）是除骨髓之外的血液。临床上常用一些方法，把骨髓中的造血干细胞释放到血液中，再从血液中提取分离得到造血干细胞，我们把这样得到的干细胞称为外周血干细胞。正常人外周血中只存在有极少量（0.01%）的造血干细胞。可利用细胞分离技术(血细胞自动分离机)，将外周血中含有造血干细胞的单个核细胞进行分离保存，重复数次达一定细胞数量后，回输给患者，以之代替骨髓而进行干细胞移植，称为外周血干细胞移植。外周血祖细胞（progenitororprecursorcell）前体细胞,发育中通过一系列分裂，能产生不同细胞谱系的细胞。祖细胞的分化更具明确性，只能分化为一些目标细胞。干细胞可以无限增值，而祖细胞分裂的次数是有限的，它只能分裂并产生某种类型的细胞。祖细胞与干细胞的特点干细胞的分类根据细胞分化潜能根据细胞来源全能干细胞三胚层多能干细胞单胚层多能干细胞单能干细胞胚胎性干细胞成体干细胞生殖干细胞干细胞的横向分化(transdifferentiation）---可塑性：成体干细胞具有分化成其他细胞或组织的潜能，大部分都可以分化为至少2～3种以上其它的组织细胞。例如：从骨髓间质中分离出的MAPC（多样成熟原始细胞）干细胞、从脐血中分离出的干细胞，可以在体内外分化出机体的任一组织。这种现象被称为干细胞的横向分化。干细胞可塑性应用该特性为干细胞的应用研究开创了更广泛的空间，有望利用病人自身健康组织产生的干细胞，诱导分化成可替代病变组织的功能细胞来治疗各种疾病。这样既克服了由于异体细胞移植而引起的免疫排斥，又避免了胚胎细胞来源不足以及其他社会伦理问题。成体干细胞的可塑性间充质干细胞主要存在于全身结缔组织和器官间质中，以骨髓组织中含量最为丰富，胎儿脐血中也可分离得到1.3干细胞的定位全能干细胞存在于桑葚胚以前的早期胚胎中胚胎干细胞存在于囊胚的内细胞团成体干细胞存在于组织器官中造血干细胞分布于骨髓腔、外周血、胸腺、脾、肝等上皮干细胞存在于皮肤表皮底层毛囊隆突部、内管腔上皮组织中神经干细胞主要存在于侧脑室室管膜区、室下带、大脑皮层、小脑皮层等部位肌组织干细胞其中的肌卫星细胞，主要分布于肌纤维膜与基底膜之间2.干细胞的生物学特性及形态学特征2.1干细胞的生物学特性①终生保持未分化或低分化状态；②机体的数目、位置相对恒定；③具有自我更新能力；④能无限分裂增殖，干细胞可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止状态；⑤具有多向分化潜能，能分化为各种不同类型的组织细胞，即具有分化发育的可塑性；⑥分裂周期慢，绝大多数细胞处于G0期；⑦干细胞通过两种方式生长：对称分裂，形成两个相同的干细胞，非对称式分裂，非对称式分裂中一个保持亲代的特性，仍作为干细胞保存下来，另外一个干细胞不可逆的走向分化的终端成为功能专一的分化细胞。2.2干细胞的形态学特征(1)ES细胞来自正常的胚胎，具有完整的二倍体核型。(2)胞体体积小、核大、胞浆少、有1～2个核仁，细胞紧集于一起，界限不清，呈集落型生长，形似鸟巢，集落边缘清晰，折光性强。(3）可以表达早期胚胎细胞特异表达的基因，如碱性磷酸酶基因(AKP)、高端粒酶基因活性。从基因表达看，ES细胞类似晚期ICM细胞。(4）具有无限增殖能力。在适宜条件下，如放在饲养层上或含有分化抑制因子的培养基中，细胞可稳定传代，长期培养。山羊EG细胞图A原代培养的EG细胞集落；图BEG集落AKP染色（引自KursadTurksen《EmbryonicStemCellProtocols》（2nd），2006）AB(5)广泛的体外分化能力。当在培养环境中去除分化抑制因素或加入诱导分化物时，ES细胞可分化成来自三个胚层的细胞。(6)广泛的体内分化能力。将ES细胞接种到同种动物或小鼠体内，可分化产生由多种不同组织组成的畸胎瘤，包括来源于三个胚层的细胞。(7)具有种系传递功能。若把ES细胞注射到受体胚胎内，ES细胞可广泛参与胚胎各组织和器官、甚至胚胎生殖细胞的发育，形成种系嵌合体。(8)可在体外培养、克隆、冻存及进行遗传操作（如导入基因、标记基因或剔除基因），因此可以通过它制备转基因、基因缺失、突变、过表达的杂合或纯合动物，并可进行各种基因功能分析。3、干细胞培养建系技术3.1ES细胞的来源早期胚胎；从终止妊娠早期的胎儿组织中可分离出多能性干细胞；体细胞核移植胚胎。（将去核的卵细胞与特定的单个体细胞用电融合法或化学融合法使两细胞相融合，细胞分裂发育并形成胚囊，然后分离内细胞群，获得胚胎干细胞）。3.2ES细胞的分离纯化3.2.1概念细胞分离(cellisolation)：指将组织材料分散制成组织悬液后，从中获取目的细胞的过程。细胞纯化(cellpurification)：更强调从原代培养前成分混杂的异质性细胞悬液中，或者从培养物中获得单一类型细胞的过程。3.2.2ES的分离全胚培养法机械剥离培养法酶学解离培养法免疫外科法克隆法全胚培养法将桑椹胚或囊胚直接培养在饲养层上，让其自然脱去透明带，贴壁，与滋养层细胞一起增殖。当ICM增殖垂直向上生长一定时间后，挑出ICM，并离散成小细胞团块，进行继代培养，克隆扩增。机械分离法采用机械方法除去胚胎滋养层细胞来分离培养ICM。用吸管或针头捶打;用组织研磨器或注射器研磨;用不锈钢或尼龙筛网搓洗等。按照组织内部同细胞的大小差异以一定孔径的不锈钢或尼龙筛网过滤细胞起到对细胞进行初步分离纯化的作用。酶学解离技术包括用胰蛋白酶及鳌合剂处理、用缓冲液浸泡等。此法主要依据不同组织的细胞和间质的构成不同。免疫外科法首先用链霉蛋白酶将胚胎的透明带除去，裸胚在抗体中处理一段时间后，再在补体中作用一段时间，使滋养层细胞发生溶解，然后直接对ICM进行培养与扩增。免疫外科法可选择性的杀死胚囊外层的滋养层细胞，而仅保留内细胞中的团细胞。克隆法将成纤维细胞或转基因的成纤维细胞注入去核的哺乳动物卵母细胞中，电融合或化学融合并激活，重组胚分裂至桑椹胚或囊胚，分离ES细胞与全胚培养法相同。以小鼠ES细胞分离为例：（1）将胚泡与兔的抗小鼠的血清共同孵育一段时间；（2）加入补体；（3）在补体作用下外层的滋养层细胞发生溶解（内细胞团细胞不受影响）；（4）胚泡内细胞团在体外适宜的生长条件下形成多种细胞集落；（5）筛选出未分化的细胞集落，培养形成ES细胞系。3.3间充质(messenchymalstemcell,MSC)干细胞的分离纯化差速贴壁法：利用不同细胞贴壁时间不同进行分离的方法（基于不同黏附特性的细胞分离方法），如利用成纤维细胞、星形胶质细胞和成鞘细胞的贴壁时间不同而将它们分离。如：葡聚糖凝胶G-10常用来分离细胞，其原理即利用细胞的黏附特性，使之黏附于葡聚糖凝胶，从而将异质性细胞悬液中具有黏附能力的细胞去除。密度梯度离心法：利用不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定离心力作用下，颗粒各自以一定速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法。叶锦等(2010),利用密度梯度离心法和差速贴壁法获得了高纯度的肌源性干细胞，并成功扩增。范萍等(2010),证明贴壁筛选法是理想的体外分离扩增骨髓间充质干细胞(BMSCs)的培养体系，所培养的BMSCs纯度高、生物学性状稳定。肖宏涛等(2010),利用贴