实验四-质粒pUC19转化大肠杆菌E.-coli-DH5a

实验四质粒pUC19转化大肠杆菌E.coliDH5a内容提要采用质粒pUC19对实验三制备得到的大肠杆菌E.coliDH5α感受态细胞进行转化，并利用抗生素来筛选转化子。本实验要求：1、掌握质粒转化实验操作技术。2、能够计算感受态细胞的转化效率。原理本实验以E.coliDH5a菌株为受体细胞，采用CaCl2法制备感受态细胞，并将pUC19质粒转化至感受态细胞。进入受体细胞的质粒通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(R¯，M¯)，它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。由于pUC19质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr)，可通过Amp抗性来筛选转化子。如受体细胞没有转入pUC19，则在含氨苄青霉素的培养基上不能生长。能在氨苄青霉素培养基上生长的受体细胞（转化子）说明已导入了pUC19。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切、测序等进一步鉴定。一、主要仪器、材料和试剂1.仪器移液器，水浴锅，台式离心机，摇床。2.实验材料大肠杆菌E.coliDH5α感受态细胞，1ml枪头，10ml离心管。3.试剂（1）100mg/ml氨苄青霉素（ampicillin）溶解1g氨苄青霉素钠盐于足量的水中，最后定容至10ml。分装成小份于-20℃贮存。常以25ug/ml～50ug/ml的终浓度添加于生长培养基。（2）LB液体培养基：蛋白胨（Tryptone）10g酵母提取物（Yeastextract）5gNaCl10g溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5，加去离子水定容至1升，高温高压灭菌20分钟。（3）LB固体培养基：液体培养基中每升加15g琼脂粉，高温高压灭菌。二、操作步骤1)在冰上缓慢融解感受态细菌(对于新鲜制备的感受态就可以直接使用了)，如果检测感受态细菌的效率，加入100pg～10ng质粒，但质粒的体积不宜超过感受态细菌量的10%。2)轻轻用手指弹动离心管，以混匀细菌和质粒。冰浴或冰水浴放置30min。3)42℃水浴，热休克2min。4)热休克后立即置于冰水浴中，2min。5)加入900μlLB，37℃、200rpm培养1小时。6)如果检测感受态效率，取100微升涂布到含有相应抗生素的LB平板上，37℃培养过夜。三、实验思考题1.为什么采用E.coliDH5α常作为基因克隆中受体菌？2.本实验体系之外，其它的转化方法和筛选体系有哪些？