大肠杆菌感受态的制备(CaCl2法)实验

实验五大肠杆菌感受态的制备（CaCl2法）1.实验目的2.实验原理3.实验仪器、材料与试剂4.实验步骤5.实验结果与讨论实验目的学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞。实验原理用于感受态细胞制备的大肠杆菌菌株一般是限制-修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。受体细胞经过一些特殊方法（如：电击法，CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许带有外源DNA的载体分子进入的感受态细胞。实验仪器、材料与试剂（一）仪器1.恒温摇床2.超净工作台3.高压灭菌锅4.低温离心机5.微量取液器（二）材料大肠杆菌DH5α。（三）试剂1.LB液体培养基2.0.1mol/LCaCl2溶液实验步骤1.挑取大肠杆菌DH5α的单菌落，接种于5mlLB液体培养基中，37℃振荡培养14hr。2.取2mL菌液加入100mlLB液体培养基中，扩大培养约2-3h；测OD600值，当OD600约0.4-0.5时，停止培养。3.菌液冰上放置10min，无菌条件下移入50mlBeckman离心管中，4℃，3,500rpm，离心5min。4.弃上清，在冰浴上加入8ml预冷的无菌CaCl2(0.1mol/L)，轻摇使细胞悬浮。冰上放置5min。5.4℃，3,500rpm离心5min。6.弃上清，用1ml预冷的无菌CaCl2(0.1mol/L)重新悬浮细胞，200μL/份分装到预冷的无菌Ep管中，4℃保存备用。（如加入15%的甘油，-70℃保存，可保存一年）。实验结果与讨论感受态细胞长时间处在常温状态，会严重影响到其转化率，因此应尽量减少常温操作，动作要迅速。为减少对细胞的机械损伤，操作时动作不能剧烈。尽量在无菌状态下操作，减少污染的可能。