第九章-维生素的测定

第九章维生素的测定第一节概述第二节脂溶性维生素的测定第三节水溶性维生素的测定一、维生素的故事•人类对维生素的认识始于3000多年前。当时古埃及人发现夜盲症可以被一些食物治愈，虽然他们并不清楚食物中什么物质起了医疗作用，这是人类对维生素最朦胧的认识。第一节概述•1519年，葡萄牙航海家麦哲伦率领的远洋船队从南美洲东岸向太平洋进发。三个月后，有的船员牙床破了，有的船员流鼻血，有的船员浑身无力，待船到达目的地时，原来的200多人，活下来的只有35人，人们对此找不出原因。•1734年，在开往格陵兰的海船上，有一个船员得了严重的坏血病，当时这种病无法医治，其他船员只好把他抛弃在一个荒岛上。待他苏醒过来，用野草充饥，几天后他的坏血病竟不治而愈了。•诸如此类的坏血病，曾夺去了几十万英国水手的生命。1747年英国海军军医林德总结了前人的经验，建议海军和远征船队的船员在远航时要多吃些柠檬，他的意建被采纳，从此未曾发生过坏血病。但那时还不知柠檬中的什么物质对坏血病有抵抗作用。第一节概述•1912年，波兰科学家丰克，经过千百次的试验，终于从米糠中提取出一种能够治疗脚气病的白色物质。这种物质被丰克称为“维持生命的营养素”，简称Vitamin(维他命），也称维生素。•随着时间的推移，越来越多的维生素种类被人们认识和发现，维生素成了一个大家族。人们把它们排列起来以便于记忆，维生素按A、B、C一直排列到L、P、U等几十种。第一节概述维生素是维持人体正常生命活动所必需的一类天然有机化合物。其种类很多，目前已确认的有30余种，其中被认为对维持人体健康和促进发育至关重要的有20余种。这些维生素结构复杂，理化性质及生理功能各异，有的属于醇类，有的属于胺类，有的属于酯类，还有的属于酚或醌类化台物。维生素的结构复杂：分为：胺类（B1）醛类（B6）醇类（A）酚醌类等维生素的命名多根据发现的时间顺序以英文字母排序，如维生素A、维生素B1、B2，维生素C，维生素E等。根据特定生理功能，如抗干眼病因子、抗坏血酸、生育酚等。按照其化学结构如视黄醇、硫胺素、烟酸、叶酸等。维生素都具有以下共同特点：化合物或其前体化合物都在天然食物中存在；不能供给机体热能，也不是构成组织的基本原料，主要功用是通过作为辅酶的成份调节代谢过程，需要量极小；一般在体内不能合成，或合成量不能满足生理需要必须经常从食物中摄取；长期缺乏任何一种维生素都会导致相应的疾病。维生素A缺乏时的具体表现为：•影响视觉，眼睛的结膜、角膜干燥，暗适应减弱，乃至夜盲。•皮肤干燥、脱屑，上皮组织改变，腺体分泌减少。•免疫力降低，反复呼吸道感染、腹泻。•头发干枯、易断，指甲无光泽。•牙质萎缩，骨骼发育不良。•味觉、嗅觉不佳、食欲差，生长发育停滞。•影响智力发育。测定食品中维生素含量的意义•评价食品的营养价值；•寻找富含维生素的食品资源；•指导人们合理调整膳食结构，防止维生素缺乏症或维生素中毒；•研究维生素在食品加工、贮存等过程中的稳定性，指导人们制定合理的加工工艺及贮存条件；•监督维生素强化食品的强化剂量，防止因摄入过多而引起维生素中毒。•脂溶性维生素：溶于脂肪或脂溶剂，在食物中与脂类共存的一类维生素，包括A、D、E、K各小类，其共同特点：是摄入后存在于脂肪组织中，不能从尿中排除，大剂量摄入时可能引起中毒；由于可储藏在脂肪中，故不需每天供给。•水溶性维生素：溶于水，包括B、C各小类，其共同特点：是一般只存在于植物性食品中，满足组织需要后都能从机体排出。需要每天供给。维生素的分类维生素的分析方法测定方法优点缺点生物鉴定法不用详尽分离费时（21天）费力（要动物饲料）微生物法选择性高，主要用于水溶性V操作繁琐，耗时过长，要有专门人员仪器分析（紫外法；荧光法）灵敏、快速、有较好的选择性各种色谱法（柱、纸、薄层层析）高分离效能，可分离、纯人、定性、定量现代高压液相色谱和气相色谱可同时完成多种V及其异构体的自动分离、检测化学分析法（比色法简便、快速、不需特殊仪器）第二节脂溶性V的测定VA、VD、VE、与类脂类物质一起存于食物中，摄食时可吸收，可在体内积贮。脂溶性维生素具有以下理化性质：1．溶解性：脂溶性维生素不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有机溶剂。2．耐酸碱性：维生素A、D对酸不稳定，对碱稳定，维生素E对碱不稳定，但在抗氧化剂存在下或惰性气体保护下，也能经受碱的煮沸。3．耐热性、耐氧化性：耐热性氧化性VA好，能经受煮沸易被氧化（光、热促进其氧化）VD好，能经受煮沸不易被氧化VE好，能经受煮沸在空气中能慢慢被化（光、热、碱促进其氧化）根据上述性质．测定脂溶性维生素时，通常：皂化样品水洗去除类脂物有机溶剂提取脂溶性维生素(不皂化物)浓缩溶于适当的溶剂测定。在皂化和浓缩时，为防止维生素的氧化分解，常加入抗氧化剂(如焦性没食子酸、维生素C等)。对于A、D、E共存的样品，或杂质含量高的样品，在皂化提取后，还需进行层析分离。国际单位：IU（InternationalUnit)1IU=0.3μgVA=0.025VD=1.79μgβ-胡萝卜素=1.1mgα-VE=3μgVB一、维生素A的测定维生素A存在于动物性脂肪中，主要来源于肝脏、鱼干油、蛋类、乳类等动物性食品中。植物性食品中不含VA，但在深色果蔬中含有胡萝卜素，它在人体内可转变为VA，故称为VA原。维生素A的性质⑴因有许多不饱和链，故见光易分解；⑵在缺氧情况下，对热较稳定，对光特别敏感。⑶对碱稳定。目前维生素A都是合成的，来源：（1）从动物肝脏中得到；（2）从维生素前体而得到（维生素前体：主要指类胡萝卜素，主要是β-胡萝卜素）维生素A的测定常用的方法有:三氯化锑比色法紫外分光光度法荧光分析法液相色谱法。比色法测定VA的含量（GB/T5009.82—2003中第二法）（一）原理在氯仿溶液中，VA与三氯化锑可生成蓝色可溶性络合物，在620nm波长处有最大吸收峰，其吸光度与VA的含量在一定的范围内成正比，故可比色测定。（二）适用范围及特点本法适用于维生素A含量较高的各种样品(高于5~10μg／g)，对低含量样品，因受其他脂溶性物质的干扰。不易比色测定。该法的主要缺点是生成的蓝色络合物的稳定性差。比色测定必须在，否则蓝色会迅速消退，将造成极大误差。6秒钟内完成2.仪器实验室常用设备分光光度计回流冷凝装置3.试剂本实验所用试剂皆为分析纯，所用水皆为蒸馏水（1）无水硫酸钠Na2SO4（2）乙酸酐（3）乙醚（不含有过氧化物）（4）无水乙醇（不含有醛类物质）（5）三氯甲烷（不含分解物，否则会破坏维生素A）检查方法：三氯甲烷不稳定，放置后易受空气中氧的作用生成氯化氢。检查时可取少量三氯甲烷置试管中加水振摇，使氯化氢溶到水层。加入几滴硝酸银溶液，如有白色沉淀即说明三氯甲烷中有分解产物。（6）25%三氯化锑-三氯甲烷溶液用三氯甲烷配制25%三氯化锑溶液，储于棕色瓶中（注意避免吸收水分）（7）50%氢氧化钾溶液（KOH）W/V（8）维生素A标准液视黄醇（纯度85%Sigma）用脱醛乙醇溶解维生素A标准品，使其浓度大约为1ml相当于1mg视黄醇。临用前用紫外分光光度法标定其准确浓度。（9）酚酞指示剂用95%乙醇配制1%溶液4.操作步骤维生素A极易被光破坏，实验操作应在微弱光线下进行。4.1样品处理：根据样品性质，可采用皂化法或研磨法。(1)皂化法：皂化：根据样品中维生素A含量的不同，称取0.5g～5g样品于三角瓶中，加入20～40mL无水乙醇及10mL50%氢氧化钾，于电热板上回流30min至皂化完全为止。（皂化法适用于维生素A含量不高的样品，可减少脂溶性物质的干扰，但全部实验过程费时，且易导致维生素A损失）提取：将皂化瓶内混合物移至分液漏斗中，以30mL水洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗。如有渣子，可用脱脂棉漏斗滤入分液漏斗内。用50mL乙醚分二次洗皂化瓶，洗液并入分液漏斗中。振摇并注意放气，静置分层后，水层放入第二个分液漏斗内。皂化瓶再用约30mL乙醚分二次冲洗，洗液倾入第二个分液漏斗中。振摇后，静置分层，水层放入三角瓶中，醚层与第一个分液漏斗合并。重复至水液中无维生素A为止。洗涤：用约30mL水加入第一个分液漏斗中，轻轻振摇，静置片刻后，放去水层。加15～20mL0.5mol/L氢氧化钾液于分液漏斗中，轻轻振摇后，弃去下层碱液，除去醚溶性酸皂。继续用水涤，每次用水约30mL，直至洗涤液与酚酞指示剂呈无色为止（大约洗涤3次）。醚层液静置10～20min，小心放出析出的水。浓缩：将醚层液经过无水硫酸钠滤入三角瓶中，再用约25mL乙醚冲洗分液漏斗和硫酸钠两次，洗液并入三角瓶内。置水浴上蒸馏，回收乙醚。待瓶中剩约5mL乙醚时取下，用减压抽气法至干，立即加入一定量的三氯甲烷使溶液中维生素A含量在适宜浓度范围内。(2)研磨法：研磨：精确称2～5g样品，放入盛有3～5倍样品重量的无水硫酸钠研钵中，研磨至样品中水分完全被吸收，并均质化。（研磨法适用于每克样品维生素A含量大于5～10μg样品的测定，如肝样品的分析。步骤简单，省时，结果准确）提取：小心地将全部均质化样品移入带盖的三角瓶内，准确加入50～100ml乙醚。紧压盖子，用力振摇2min，使样品中维生素A溶于乙醚中。使其自行澄清（大约需1～2h），或离心澄清（因乙醚易挥发，气温高时应在冷水浴中操作。装乙醚的试剂瓶也应事先置于冷水浴中）。浓缩：取澄清提取乙醚液2～5mL，放入比色管中，在70～80℃水浴上抽气蒸干。立即加入1mL三氯甲烷溶解残渣。4.2标准曲线的制备:准确取一定量的维生素A标准液于4～5个容量瓶中，以三氯甲烷配制标准系列。再取相同数量比色管顺次取1mL三氯甲烷和标准系列使用液1mL，各管加入乙酸酐1滴，制成标准比色系列。于620nm波长处，以三氯甲烷调节吸光度至零点，将其标准比色列按顺序移入光路前，迅速加入9mL三氯化锑-三氯甲烷溶液。于6秒内测定吸光度，将吸光度为纵坐标，以维生素A含量为横坐标绘制标准曲线图。4.3样品测定:于一比色管中加入10mL三氯甲烷，加入一滴乙酸酐为空白液。另一比色管中加入1mL三氯甲烷，其余比色管中分别加入1mL样品溶液及1滴乙酸酐。其余步骤同标准曲线的制备。注意：1.维生素A见光易分解，整个实验应在暗处进行，防止阳光照射，或采用棕色玻璃避光。2.三氯化锑腐蚀性强，不能沾在手上，三氯化锑遇水生成白色沉淀。因此用过的仪器要先用稀盐酸浸泡后再清洗。说明：1，本法为国家标准方法，适用于食品中维生素Ａ的测定。2，乙醚为溶剂的萃取体系，易发生乳化现象，在提取前，洗涤操作中，不要用力过猛，若发生乳化，可加几滴乙醇消除乳化。3，所用氯仿中不应含有水分，因三氯化锑遇水会出现深沉，干扰比色测定。故在每1mL氯仿中应加入乙酸酐１滴，以保证脱水。４，由于三氯化锑与维生素Ａ所产生的蓝色物质很不稳定，通常6s以后便开始褪色，因此要求反应在比色皿中进行，产生蓝色后立即读取吸光度值。5，如果样品中含β－胡萝卜素（如奶粉、禽蛋等食品）干扰测定，可将浓缩蒸干的样品用正己烷溶解，以氧化铝为吸附剂，丙酮－己烷混合液为洗脱剂进行柱层析。二、维生素D的测定维生素D是指含有抗佝偻病活性的一类物质，又称钙化醇，是类固醇的衍生物，是一类关系钙、磷代谢的活性物质。具有维生素D活性的化合物约有10种，其中最重要的是维生素D2、维生素D3及其维生素D原。维生素D2无天然存在，维生素D3只存在于某些动物性食物中。但它们都可由维生素D原(麦角固醇和7一脱氢胆固醇)经紫外线照射形成。维生素D2药片吃多了中毒。分析方法中较好的是比色法和高效液相色谱法。(一)三氯化锑比色法(二)高效液相色谱法它的灵敏度较比色法高30倍以上，且操作简便，精度高，分析速度快。是目前分析维生素D的最好方法。三氯化锑比色法原理•在三氯甲烷溶液中，维生素D与三氯化锑结合生成一种黄色化合物，呈色强度与维生素D含量呈正比。•食品中维生素D含量较低，其他维生素严重干扰其测定，因此测定前必须经柱层析除去干扰成分。层析介质为硅藻土、中性氧化铝洗脱液样品填充物分部收集玻璃柱说明1，食品中维生素D的含