硕士研究生毕业论文答辩

’slymphomaRajicellsapoptosis肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体[tumorsnecrosisfactor(TNF)-relatedapotosis–inducingligand,TRAIL]，是新发现的肿瘤坏死因子TNF家族成员，它能够选择性地诱导多种肿瘤细胞凋亡，但不影响正常体细胞的生长分化，故而应用重组TRAIL进行肿瘤治疗已引起人们极大的兴趣。能诱导多种白血病、肺癌、胃癌等细胞株凋亡，并且呈时间和剂量依赖性。但是后来的研究发现，部分肿瘤细胞对TRAIL诱导的凋亡作用并不敏感，且TRAIL重复作用会导致某些敏感细胞对TRAIL产生获得性抗性，这与TRAIL介导的复杂的生物学功能有关。％有五个受体：TRAILR1（DR4）、TRAILR2（DR5）、TRAIL-R3（DcR1）、TRAIL-R4（DcR2）、OPG。包括胞外区、跨膜区及胞内区三个部分由281个氨基酸残基组成的分子量约为32.5kD的Ⅱ型跨膜糖蛋白TRAIL(nuclearfactor-kappaB）与Rel家族有较强的同源性，所以又称为Rel/NF-κB家族有多个成员如：Rel(p65）、RelB、C-Rel、NF-κB1(p50)、NF-κB2(p52)等静息状态通常与其抑制物IκB结合成三聚体存在于胞浆中。在刺激因子作用下，NF-κB二聚体释放并发生核易位。除与机体的免疫应答、炎症反应密切相关外，还可调控细胞增殖和凋亡相关基因参与肿瘤的生长调控。NF-κB凋亡信号传导过程中具有协同作用，促进细胞发生凋亡.NF-κB在TRAIL凋亡信号传导过程中的作用Tafuku等则认为NF-κB主要参与拮抗TRAIL的诱导凋亡作用，NF-κB的激活正是EBV阳性淋巴瘤对TRAIL不敏感的原因。、PDTC单独及联用时对Raji细胞的生长抑制率TUNEL检测TRAI、PDTC单独及联用时Raji细胞凋亡情况观察不同浓度TRAIL、PDTC单独及联用时DR4、DR5、及核内NF-κB的表达吡咯二硫代氨基甲酸盐（PDTC）为NF-κ特异性抑制剂试剂盒核蛋白抽提试剂盒、PMSF、EDTADMEM粉剂、FBS、PMSGHCGwesternblotting相关试剂、硝酸纤维素膜、超敏发光液主要试剂人重组TRAIL蛋白吡咯二硫代氨基甲酸盐（PDTC）细胞购自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库。细胞，用含l0％灭活小牛血清的RPMI-1640培养液，在常规5％CO2，37℃饱和湿度下培养，3d传代1次。取对数生长期细胞用于实验。一、细胞培养二、实验分组1.细胞对照组2.TRAIL（100ng/ml）组3.TRAIL（10ng/ml）组4.TRAIL（1ng/ml）组5.TRAIL（1ng/ml）及PDTC（100μmol/ml）组6.TRAIL（10ng/ml）及PDTC（100μmol/ml）组7.TRAIL（100ng/ml）及PDTC（100μmol/ml）组8.PDTC（100μmol/ml）组×105种板三块，每孔90μl。再加入不同浓度药物补足100μl实验分组如上。培养箱中分别培养12h、24h、48h培养箱中孵育4h后每孔加入100μl三联液全自动酶标仪测570nm处吸收值。计算细胞生存率及抑制率并采用Weeb系数判定联合用药的相互作用三、四甲基偶氮唑盐（MTT）比色法检测不同时间不同处理因素作用下Raji细胞的生长情况离心3min后弃上清，每孔各加入180μl1640液及20μlMTT液混匀培养箱中放置24h，5min×20.2%TritonX-100中处理5minPBS,5min×2加100μLTdT酶加100μL2×SSC室温15min0.3%的H2O23min四、TUNEL方法检测不同处理组细胞凋亡收集细胞并涂片自然干燥后4％多聚甲醛中固定25min滴加100μLEquilibrationBuffer室温平衡5min吸去多余液体37℃60minPBS,5min×3PBS,5min×3100μLStreptavidin-HRP5minPBS5min×3DAB显色复染、透明、封片显微镜下观察并拍照、计算凋亡指数阳性结果判定：TUNEL标记后，凋亡Raji细胞核呈棕黄色。阴性对照：不添加TdT酶，其余与实验组步骤完全相同。HE染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。计算凋亡指数(Apoptoticindex,AI)：数4个高倍视野，分别计算凋亡细胞和总细胞数，AI（%）=凋亡细胞数/总细胞数×100%质量控制五、免疫蛋白印迹离心收集不同处理24h后各组细胞每管加3ml，4℃PBS并吹打成悬液离心，去上清×3次每管细胞加400l含PMSF的裂解液，冰上充分裂解（30min）4℃12000rpm离心5min收集上清并分装保存于－20℃冰箱中同时测蛋白含量总蛋白提取示意图℃离心，16000×g，5min收集上清（浆蛋白）后往沉淀物中加入100μL冷BufferC每10min振荡15s剧烈振荡15s置于冰上40min每管加3ml，4℃PBS并吹打成悬液离心，去上清×3次4℃16000×g离心10min收集上清并分装保存于－20℃冰箱中同时测蛋白含量、DR5及核内NF-κB蛋白的表达从－20℃冰箱中取出蛋白样沸水中煮5min统计处理计数量资料采用±s表示,进行方差分析，组间比较用LSD法WesternBlotting图片用Imagetool软件进行灰度值分析,行单因素的方差分析用SPSS13.0软件对数据进行处理以P＜0.05有统计学意义,P＜0.01有显著统计学意义LOGO结果后细胞单个呈圆形，透亮，悬浮在细胞培养液中：24h后，细胞圆形，透亮，悬浮在培养液中，三两个细胞开始出现抱团现像，48h后，细胞抱团现象普遍。Raji:12h10×25Raji:24h10×25Raji:48h10×253.1体外培养Raji细胞形态学观组TRAIL10ng/ml组TRAIL100ng/ml组TRAIL1ng/ml＋PDTC100μmol/ml组TRAIL10ng/ml＋PDTC100μmol/m组TRAIL100ng/ml＋PDTC100μmol/组PDTC100μmol/ml组----35.52±5.64-15.07±2.036.68±1.171.18±0.51*4.96±1.34*14.63±2.57*1.01±0.21----20.12±1.58-11.56±3.4518.97±1.243.43±0.26*10.35±0.62*59.11±2.01*1.87±0.43----24.16±4.77-5.12±1.2233.54±1.52△4.87±0.85*28.36±1.82*△88.49±1.40*△2.12±0.333.2单用TRAIL、PDTC、TRAIL联合PDTC对Raji细胞的生长抑制作用及两药联用时的协同作用分析表3.1各组不同时间点Raji细胞抑制率的比较（±s，％）Tab3.1InhibitoryrateofRajicellsineverygroupatdifferenttimepoints（±s，％）*P0.01，联合用药组与相同浓度TRAIL单用及PDTC组比较；△P0.05，与同组12h、24h比较。预估生存率TRAIL1ng/ml组TRAIL10ng/ml组TRAIL100ng/ml组TRAIL1ng/ml＋PDTC100μmol/ml组TRAIL10ng/ml＋PDTC100μmol/ml组TRAIL100ng/ml＋PDTC100μmol/ml组PDTC100μmol/ml组124.16105.1266.4695.1271.6411.5197.88---------85.0772.0245.54---表3.2各联合给药的相互作用分析（%）Tab3.2TheinteractionanalysisofeveryTRAILco-treatedwithPDTCgroup采用Weeb系数来判定联合应用PDTC的相互作用，预估效应C＝A×B，其中A、B分别指两药单用时的细胞生存率。当实际生存率≤70％预估效应时，联合处理即表现出协同作用。染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。附图3.28TRAIL（10ng/ml+PDTC100μmol/ml）作用24h后HE染色(×400)附图3.28TRAIL（100ng/ml+PDTC100μmol/ml）作用24h后HE染色(×400)阴性对照(×250)附图3.17TRAIL（10ng/ml）作用48h后TUNEL检测(×250)经TUNEL法染色和苏木素复染后，非凋亡细胞核呈蓝色，而凋亡细胞核内可见染成棕黄色颗粒状的凋亡小体。w