酶工程实验(new)

酶工程实验西北民族大学生命科学与工程学院柏家林刘俊林仅供2008级生物工程专业和生物技术专业本科生试用1前言生物工程已成为发展最快、应用最广、潜力最大、竞争最为激烈的科技领域之一，也是最有希望取得关键性突破的学科之一。生物工程产业作为一个正在崛起的主导性产业，已成为产业结构调整的战略重点和新的经济增长点，将成为我国赶超世界发达国家生产力水平、实现后发优势和跨越式发展最有前途、最有希望的领域。酶工程是生物工程的四大重要组成部分之一，是酶学和工程学相互渗透、相互结合发展而形成的一门新的技术科学，是酶学、微生物学的基本原理与化学工程等有机结合而产生的边缘学科。酶作为生物催化剂具有催化专一性好、效率高、作用条件温和等优点，已广泛应用于医药、食品、轻工、化工、能源、环保、检测、生物技术等领域，深刻影响着许多重要的科学和实践领域。《酶工程实验》与教材内容紧密结合,旨在通过实验强化学生对课堂内容的理解和掌握。结合我院实验条件，《酶工程实验》选择了十三个实验，主要集中在酶及酶工程概论、微生物发酵产酶、酶的提取和分离纯化、酶活力测定、酶的固定化和酶的分子修饰等章节，基本上反映了教材内容。《酶工程实验》可作为生物技术、生物工程、食品生物技术、生物制药等专业学生的参考用书，也可供相关行业的技术人员参考。编者柏家林刘俊林二00九年十二月2目录实验一酶促反应中初速度时间范围测定实验二pH对酶活力的影响—最适pH的测定实验三温度对酶活力的影响—最适温度的测定实验四米氏常数和最大反应速度的测定实验五抑制条件下米氏常数和最大反应速度的测定及抑制类型的判定实验六碱性蛋白酶的吸附固态发酵生产实验七溶菌酶的提纯结晶实验八α-淀粉酶活力测定实验九酸性磷酸酯酶的提取和酶活力测定实验十溶菌酶的制备及活力测定实验十一果胶酶的固定化实验十二固定化酶活力测定实验十三胆绿素还原酶的修饰与活性基团的鉴定3实验一酶促反应中初速度时间范围测定一、实验目的1.了解酶促反应中初速度时间范围测定的基本原理；2.掌握酶促反应中初速度时间范围的测定方法。二、实验原理酸性磷酸酯酶（acidphosphatase,EC3.1.3.2）广泛分布于动植物体中，尤其是植物的种子、动物肝脏和人体的前列腺中。它对生物体内核苷酸、磷蛋白和磷脂的代谢起着重要作用。酸性磷酸酯酶能专一性水解磷酸单酯键。以人工合成的对硝基苯磷酸酯（4-nitrophenylphosphate,NPP）作底物，水解产生对硝基苯酚和磷酸。在碱性溶液中，对硝基酚的盐离子于405nm处光吸收强烈，而底物没有这种特性。利用产物的这种特性，可以定量的测定产物的生成量，从而求得酶的活力单位。即通过测定单位时间内405nm处光吸收值的变化来确定酸性磷酸酯酶的活性。酸性磷酸酯酶的一个活力单位是指在酶反应的最适条件下，每分钟生成1μmol产物所需的酶量。要进行酶活力测定，首先要确定酶反应时间。而酶的反应时间应该在初速度时间范围内选择。可以通过进程曲线的制作来求出酶的初速度时间范围。进程曲线的制作是指在酶反应的最适条件下，采用每隔一定时间测定产物生成量，以酶反应时间为横坐标，产物生成量为纵坐标绘制而成。从进程曲线可知，在曲线起始的一段时间内为直线，其斜率代表初速度。随着反应时间的延长，曲线趋于平坦，斜率变小，反应速度下降。要真实反映出酶活力大小，就应在初速度时间内测定。三、实验试剂与器材1.试剂（1）酸性磷酸酯酶原液（从绿豆芽中提取）（2）酸性磷酸酯酶液（通过原酶液稀释得到）取原酶液，用0.05mol/L、pH5.0柠檬酸盐缓冲液稀释，使进程曲线中第11号管吸光度A405在0.6～0.7之间。（3）1.2mmol/L对硝基苯磷酸酯精确称取NPP0.4454g，加缓冲液定容至100mL。4（4）0.3mol/LNaOH溶液2．器材恒温水浴槽，可见分光光度计，试管，刻度吸管，离心机。四、操作步骤1.酸性磷酸酯酶原酶液的制备称取一定重量的绿豆，浸泡24h，在25～30°C温箱中培养5～7d。长出的豆芽取其颈部，依次用自来水和重蒸水冲洗干净，置滤纸上吸干水分，称30g放入研钵中匀浆，加0.2mol/L乙酸盐缓冲液4mL，置4°C冰箱中6h以上。然后用双层纱布挤压过滤，滤液6000r/min离心15min,上清液置透析袋用蒸馏水充分透析，间隔换水10次，透析24h以上。将透析后酶液稀释至最终体积与豆芽质量（g）相等，以6000r/min离心30min，所得上清液即为原酶液，置冰箱待用。2.酶促反应取试管12支，按表1.1编号，0号为空白。各管加入1.0mL1.2mol/LNPP；另外2支试管，各加入稀释好的酶液7mL，在酶反应前底物与酶都放入35°C恒温水浴槽中预热2min。然后向1～11号管内各加入1.0mL预热的酶液。立即摇匀并开始计时。按时间间隔为3min、5min、7min、10min、12min、15min、20min、25min、30min、40min、50min进行反应。待反应进行到上述各相应时间时，加入3.0mL0.3mol/LNaOH终止反应。冷却后以0号管作空白（0号管加入1.0mLNPP后保温25min，然后加入3.0mL0.3mol/LNaOH，再加入1.0mL酶液），在分光光度计上测定各管A405值。3.数据处理以反应时间为横坐标，A405值为纵坐标绘制进程曲线。由进程曲线中直线部分求出酸性磷酸酯酶反应初速度的时间范围。表1.1制作酶促反应进程曲线时各物质加入量试管号12345678910110NPP（mL）稀释酶液(mL)反应时间（min）0．3MNaOH(mL)1.01.033.01.01.053.01.01.073.01.01.0103.01.01.0123.01.01.0153.01.01.0203.01.01.0253.01.01.0303.01.01.0403.01.01.0503.01.01.0253.05五、实验报告绘出酶促反应进程曲线，记录实验结果，计算酸性磷酸酯酶反应初速度的时间范围。实验二pH对酶活力的影响—最适pH的测定一、实验目的1.了解pH对酶活力影响的机理；2.掌握测定最适pH的基本原理；3.掌握最适pH测定方法。二、实验原理pH对酶活力的影响极为显著。酶表现其最高活性时所处的pH即酶的最适pH。通常各种酶只在一定的pH范围内才能表现它的活性。一种酶在不同的pH条件下所表现出来的活性不同。pH之所以对酶活性有很大影响，可能是它改变了酶活性部位有关基团的解离状态。在最适pH时，酶分子上活性基团的解离状态最适于酶与底物的结合。而高于或低于最适pH时，酶活性部位基团的解离状态均不利于酶与底物的结合，酶活力也就相应降低。pH也可影响底物的解离及反应体系中其它组分的解离。缓冲体系中离子的性质和离子强度也可能对酶促反应产生影响。另外，pH除了对酶活性有很大影响外，对酶的稳定性也有影响。过高或过低的pH都会改变酶的活性中心的构象，甚至改变整个酶分子的结构而使其变性失活。在保持其它反应条件恒定，而在一系列变化的pH下测定酶活力，以pH为横坐标，OD405值为纵坐标作图，可得到一条pH—酶活力曲线，从中就可求出最适pH。三、试剂与器材1.试剂（1）酸性磷酸酯酶原酶液（2）酸性磷酸酯酶酶溶液将原酶液用水稀释10倍左右，使pH—酶活力曲线中第六管OD405在0.6～0.7之间。（3）2.4mmol/LNPP水溶液精确称取NPP0.8908g，用水溶解并定容至1000mL。6（4）0.3mol/LNaOH溶液。（5）各pH缓冲液①0.05mol/L柠檬酸溶液。②0.05mol/L柠檬酸三钠溶液。2．器材恒温水浴槽，可见分光光度计，试管，刻度吸管。表2.1各pH缓冲液配制0.05mol/L柠檬酸（mL）10082715947352311.5410.05mol/L柠檬酸三钠（mL）018294153657788.59699pH2.03.03.54.04.55.05.56.06.57.0四、操作步骤1.酶促反应取11支试管编号，0号为空白。各加入2.4mol/LNPP0.2mL，相应加入不同缓冲液各1.8mL，每管再各加入35°C预保温（另取2支试管，各加入稀释好的酶液5～6mL，于35°C恒温水浴槽中保温2min）的酶液1mL，立即摇匀计时，15min后加入0.3mol/LNaOH2.0mL终止反应。2.测定OD405值0号管先加入0.3mol/LNaOH2.0mL后再加入酶液，各管终止并冷却后测OD405，将结果按不同pH对应记录。3.数据处理以反应pH为横坐标，OD405为纵坐标，绘制pH—酶活力曲线，求出酸性磷酸酯酶的最适pH。四、实验报告绘出pH—酶活力曲线图，记录实验结果，计算酸性磷酸酯酶最适pH。实验三温度对酶活力的影响—最适温度的测定一、实验目的1.了解湿度对酶活力影响的机理；2.掌握测定最适温度的基本原理；73.掌握最适温度测定方法。二、实验原理温度对酶的影响有双重作用。一方面，温度加速酶促反应的速度；另一方面酶是蛋白质，温度升高会引起酶蛋白质的变性。因此，在较低温度范围内，酶促反应速度随温度升高而增大，超过一定温度后，反应速度下降。酶促反应速度达到最大值时的温度称酶促反应的最适温度。如果保持其它反应条件恒定，而在一系列变化的温度下测定酶活力，以温度为横坐标，反应速度为纵坐标作图，可得到一条温度-酶活力曲线，从中就可求得最适温度。各种酶的最适反应温度是不同的，一般动物组织中各种酶的最适温度在35～40°C，植物和微生物中各种酶的最适温度范围较大，大约在32～60°C之间。但最适温度不是酶的特征常数，一种酶的最适温度不是一个恒定的数值，它与反应条件有关。如果反应时间延长，一般最适温度降低。因此，对同一种酶来讲，应该说明是在什么条件下的最适温度。温度是影响酶促反应速度的重要因素之一。在温度较低时，绝对温度对Vmax的影响遵守Arrnenius公式：lgVmax=-Ea/2.3R(1/T)+常数式中，Ea表示酶促反应的活化能，J·mol-1；R表示气体常数，8.314J·mol-1·K-1；T表示绝对温度，K；Vmax表示当酶全部被过量底物饱和时所测得的反应速度。实验时，测定不同温度下酶促最大反应速度Vmax，以lgVmax对绝对温度的倒数1/T作图，得一斜率等于-Ea/2.3R的直线，由此可求得活化能Ea。三、试剂与器材1.试剂（1）酸性磷酸酯酶原液（2）酸性磷酸酯酶酶液将原酶用0.05mol/L柠檬酸缓冲液稀释25倍左右，使测定的第五管OD405值在0.6～0.7之间。（3）1.2mmmol/LNPP精确称取NPP0.4454g，用缓冲液溶解定容至1000mL。（4）0.3mol/LNaOH82.器材恒温水浴槽，可见分光光度计，试管，刻度吸管。四、操作步骤1.酶促反应取8支试管，编号制表，0号管为空白。各管加入1.2mmol/LNPP1.0mL，另取8支试管加入酶液2mL。酶与底物对应在10°C、20°C、30°C、35°C、40°C、50°C、60°C、70°C恒温水浴槽保温2min。酶液预热时间不要超2min，否则酶易失活，特别是在温度较高时。预热后各管加入酶液1.0mL，精确反应15min后，加入0.3mol/LNaOH3.0mL终止反应。2.测定OD405值0号管反应温度为50°C，先加入0.3mol/LNaOH3.0mL后再加入酶液。各管反应终止并冷却后以0号管为空白，测定OD405值。3.数据处理①以反应温度为横坐标，A680（代表反应速度）为纵坐标，绘制温度酶活力曲线，求出酸性磷酸酯酶在此条件下的最适温度。②以反应绝对温度的倒数（1/T）为横坐标，lgA405为纵坐标作图，求出直线部分的斜率，计算酶促反应的活化能。五、实验报告绘制温度-酶活力曲线图，记录实验结果，计算酸性磷酸酯酶最适温度；绘制Arrnenius图，计算本酶促反应的活化能。实验四米氏常数和最大反应速度的测定一、实验目的1.了解米氏方程的含义及其重要意义；2.掌握测定米氏常数（Km）和最大瓜速度（Vmax）的基本原理；3.掌握K