SPR技术

表面离子体共振Surfaceplasmonresonance组员：Outline•SPR技术简介•SPR仪器介绍•SPR应用•SPR技术简介1.表面等离子体共振（Surfaceplasmonresonance，SPR），又称表面等离子体子共振，表面等离激元共振，是一种物理光学现象，有关仪器和应用技术已经成为物理学、化学和生物学研究的重要工具。2.发展概史1902年，Wood在光学实验中发现SPR现象1941年，Fano解释了SPR现象1971年，Kretschmann结构为SPR传感器奠定了基础1983年，liedberg将SPR用于IgG与其抗原的反应测定1987年，Knoll等人开始SPR成像研究1990年，BiacoreAB公司开发出首台商品化SPR仪器••••••SPR原理什么是等离子体？等离子体=PLASMA=电浆等离子体的发现：等离子体通常指由密度相当高的自由正、负电荷组成的气体，其中正、负带电粒子数目几乎相等，是物质存在的一种状态，与固态、液态和气态并列，称为物质的第四态。宇宙中大部分物质处于等离子状态。1879年，英国物理学家WilliamCrookes----物质第四状态1929年，美国化学物理学家Langmuir----等离子体等离子体成分，对外呈现电中性等离子体是由大量带电粒子组成的非凝聚系统，它的主要特征是：1、离子间存在长程库仑作用。2、等离子的运动与电磁场的运动紧密耦合，形态和性质受外加电磁场的影响强烈。3、存在极其丰富的集体效应和集体运动模式(如各种静电波、漂移波等)。4、等离子体对边界条件十分敏感。在金属中，价电子为整个晶体所共有，形成所谓费米电子气。价电子可在晶体中移动，而金属离子则被束缚于晶格位置上，但总的电子密度和离子密度是相同的，从整体来说金属是电中性的。人们把这种情况形象地称为“金属离子浸没于电子的海洋中”。这种情况和气体放电中的等离子体相似，因此可以把金属看作是一种电荷密度很高的低温（室温）等离子体，而气体放电中的等离子体是一种高温等离子体，电荷密度比金属中的低。金属板中电子气的位移（上）金属离子（+）位于“电子海洋”中（灰色背景），（下）电子集体向右移动什么是金属等离子体？？？等离子波e正电荷过剩区域库仑力引力斥力平衡点电子间相互斥力当金属受到电磁干扰时，金属中的电子密度分布就会变得不均匀。设想在某一区域电子密度低于平均密度，那么就会形成局部的正电荷过剩。这时由于库仑引力作用，会把近邻的电子吸引到该区域，而被吸引的电子由于获得附加的动量，又会使该区域聚集过多的负电荷，然而，由于电子间的排斥作用，使电子再度离开该区域，从而形成价电子相对于正电荷背景的起伏振荡。由于库仑力的长程作用，这种局部的电子密度振荡将形成整个电子系统的集体振荡，即等离子震荡，并以密度起伏的波的形式来表现，称为等离子波。表面等离子体振动产生的电荷密度波，沿着金属和电介质的界面传播，形成表面等离子体波，其场矢量在界面处达到最大，并在两种介质中逐渐衰减。表面等离子体波是TM极化波，即横磁波（TransverseMagneticmode），其磁场矢量与传播方向垂直，与界面平行，而电场矢量则垂直于界面。表面等离子体波（Surfaceplasmawave，SPW）全反射n1sinθ1=n2sinθ2菲涅尔定理：密疏密疏当光从光密介质射入光疏介质（n1＞n2），入射角增大到某一角度，使折射角达到90°时，折射光将完全消失，而只剩下反射光，这种现象叫做全反射。当以波动光学的角度来研究全反射时，人们发现当入射光到达界面时并不是直接产生反射光，而是先透过光疏介质约一个波长的深度，再沿界面流动约半个波长再返回光密介质，而光的总能量没有发生改变。则透过光疏介质的波被称为消逝波。界面疏密消逝波SPR基本原理它利用P偏振光在玻璃与金属薄膜界面处发生全内反射时渗透到金属薄膜内的消失波,引发金属中的自由电子产生表面等离子体子,当表面等离子体与消失波的频率相等时,二者将发生共振,界面处的全反射条件将被破坏,呈现衰减全反射现象，入射光被金属表面电子吸收,使反射光能量急剧下降SPR基本原理当入射光波长固定时，反射光强度是入射角的函数，其中反射光强度最低时所对应的入射角称为共振角SPR检测原理SPR对附着在金属薄膜表面的介质折射率非常敏感,当表面介质的属性改变或者附着量改变时，共振角将不同。因此，SPR谱（共振角的变化vs时间）能够反映与金属膜表面接触的体系的变化。棱镜耦合棱镜是SPR研究中应用最为广泛的光学耦合器件。棱镜由高折射率的非吸收性的光学材料构成，其底部镀有厚度为50nm左右的高反射率的金属薄膜（一般为金或银），膜下面是电介质。在SPR传感器中，该电介质即为待测样品。由光源发出的p-偏振光以一定的角度θ0入射到棱镜中，在棱镜与金属的界面处将发生反射和折射。当θ0大于临界角θc时，光线将发生全内反射，即全部返回到棱镜中，然后，从棱镜的另一个侧面折射出去。这里入射光应当用p-偏振光，因为其电场分量与界面垂直，这与表面等离子体波的情况一致。传感器的基本原理•表面等离子体子共振的产生与入射光的角度θ、波长、金属薄膜的介电常数s及电介质的折射率ns有关，发生共振时θ和分别称为共振角度和共振波长。对于同一种金属薄膜，如果固定θ，则与ns有关；固定，则θ与ns有关。•如果将电介质换成待测样品，测出共振时的θ或，就可以得到样品的介电常数s或折射率ns；如果样品的化学或生物性质发生变化，引起ns的改变，则θ或也会发生变化，这样，检测这一变化就可获得样品性质的变化。•固定入射光的波长，改变入射角，可得到角度随反射率变化的SPR光谱；同样地，固定入射光的角度，改变波长，可得到波长随反射率变化的SPR光谱。SPR光谱的改变反映了体系性质的变化。传感器的基本结构•一般来说，一个SPR传感器的包括：光学系统、敏感元件、数据采集和处理系统。•SPR传感器的光学部分包含光源、光学耦合器件、角度（或波长）调节部件以及光检测器件，用于产生SPR并检测SPR光谱的变化。•敏感元件主要指金属薄膜及其表面修饰的敏感物质，用于将待测对象的化学或生物信息转换成折射率的变化，是SPR传感器的关键。从SPR的原理可知，实际上是样品的折射率的变化引起SPR光谱的变化。如果金属薄膜未经任何修饰，这样的传感器是没有什么选择性的，只能用于一些简单体系的测定，因而一般都要进行修饰，以获得对被测对象的选择性识别能力。•数据采集和处理系统用于采集和处理光检测器产生的电子信号。现在光检测器越来越多地采用阵列检测器，如光电二极管阵列和电荷耦合器件，以便同时检测多个角度或波长处的信号变化。数据采集和处理均由计算机完成。4种检测方式1.角度调制：固定λin，改变θin2.波长调制：固定θin，改变λin3.强度调制：固定θin、λin，改变光强4.相位调制：固定θin、λin，测相差•一个SPR传感器的主要性能特点，如灵敏度、稳定性、分辨率、选择性和响应时间等，取决于其各个组成部分的性能。•SPR传感器使用时，一般是先在金属薄膜表面修饰一层敏感物质，以便与样品中的待测组分选择性地作用。这一相互作用会引起敏感层折射率的改变，导致SPR信号的变化，从而获得待测样品的化学或生物信息。如果不对金属薄膜进行修饰，这样的传感器也可用于一些简单体系的检测，如一些浓度随折射率变化的溶液（乙醇、蔗糖、葡萄糖等的水溶液）。金和银相对来说比较稳定，且反射率高，是比较常用的两种金属。在生物体系的测量中，常常有氯离子存在，用银膜不太合适，一般都用金膜。SPR传感器的基本结构1.光波导耦合器件2.金属膜3.分子敏感膜光波导耦合器件Krestschmann棱镜型Otto棱镜型光纤在线传输式光纤终端反射式光栅型金属膜分子敏感膜金属膜反射率高化学稳定性好Au膜和Ag膜是SPR中最常用的两种金属薄膜膜的厚度：50-100nm分子敏感膜成膜方法：1.金属膜直接吸附法2.共价连接法（生物素-亲和素、葡聚糖凝胶、水凝胶、高分子膜、多肽等）3.单分子复合膜法4.分子印膜技术SPR的优点1.待测物无需标记2.适用于混浊、不透明或者有色溶液3.能实时、连续监测反应动态过程4.检测方便、快捷5.应用范围广SPR缺点1.难以区分非特异性吸附2.对温度、样品组成等干扰因素敏感SPR技术发展动态1.提高检测灵敏度2.高通量检测（SPRimaging）3.与质谱等高分辨仪器联用4.敏感器件及测量装置的微型化提高SPR检测灵敏度的方法•纳米技术的应用以纳米粒子作为载体，夹心法测定•采用新型检测方法光声光谱(PAS)、光热偏转光谱(PDS)、反射干涉光谱、EllipsometricMicroscopy、电化学法微流控多通道SPR检测Anal.Chem.2001,73:5525-5531SPR扫描显微镜OpticsCommunications2000,182:11–15多波长SPR成像a630nm，b690nm，c750nm.Rev.Sci.Instrum.2000,71:3530-3538SPR-MSAnal.Chem.2000,72,4193-4198SPR-MSAnal.Chem.(2000)404A-411A微型化Biacore2000Dimensions:760x350x610mmNetWeight:50kgSpreeta2000微流控SPR芯片TheIntegratedmicrofluidicsCartridgesusedintheBiacore®3000SPR的应用对生物分子进行识别及定量检测研究生物分子间的相互作用用SPR可获得的信息：1.两个分子之间结合的特异性2.目标分子的浓度3.结合以及解离过程的动力学参数4.结合的强度ElucidatethefunctionofnovelproteinsinproteomicsresearchIdentifybindingpartnerstoanytargetmolecule–ligandfishingDeterminethenatureofproteincomplexesandtheirfunctionUnraveltheintricatemolecularinteractionsinvolvedincellsignalingpathwaysStudymembraneassociatedmoleculesinnearnativeenvironmentsApplicationsinlifescienceresearchApplicationsinlifescienceresearchDetermineexpressionlevelsofselectedproteinsunderdifferentconditions,forexample,health,disease,drugtreatmentInvestigatethebindingpropertiesofproteinisoformsFindantagoniststocriticalbindingeventsIdentifydiseasemarkersinclinicalsamplesOptimizetherapeuticantibodiesEvaluateionselectivityinsignalingpathwaysIdentifyDNAdamage–mutations,DNAadductsetcApplicationsinDrugDiscoveryProteomics–targetidentificationandligandfishingTargetandassayvalidationforHighThroughputScreening(HTS)‘Hit’toleadcharacterization–rapidaffinityrankinganddetailedkineticsofinteractionforsmallmoleculesbindingtotargetpr