Waters高效液相色谱柱简单介绍与选择

Waters高效液相色谱柱简单介绍与选择2016-04-25BruceLee生产高效液相色谱柱的厂家有很多，如Waters，Agilent，Phenomenex，Shimadzu，Thermo等，每家供应商又生产多个系列，导致市场上的液相色谱柱的可选择性极强。目前实验室以及公司，企业使用最多的是Waters以及Agilent所生产的RP液相色谱柱。Waters主要有Symmetry，Sunfire，XTerra，XBridge，XSelect，CORTECS以及Atlantis系列等，其详细分类以及键合相如下。Figure1WatersSymmetrycolumnfamilyFigure2WatersSunfirecolumnfamilySymmetry与Sunfire系列色谱柱使用高纯度硅胶（B型）作为固定相基质，摒除金属离子杂质对固定相Si-O键的促进水解作用，此外由于金属离子含量特别低，在对其表面键合选择性烃基或内嵌极性官能团烃基时，可通过配体添加量控制硅胶表面键合相的多少，因此其最大特点在于批次之间的重现性。两个系列均采用封端技术，SunfireC8与C18表面载碳量分别为12%和16%；SymmetryC8与C18载碳量均为12%，因此两个系列的C8色谱柱对于分析物的保留能力上没有本质的区别，而SunfireC18色谱柱则相比SymmetryC18色谱柱，对于非极性比较大的分析物具有更强一些的保留能力，当然对于有机相的最低比例也相对比较高一些。SymmetryC8Prep与C18Prep色谱柱的填料粒径为7um，其设计用途为制备；Symmetry300C18（孔径300埃，载碳量8.5%）与Symmetry300C4（孔径300埃，载碳量2.8%）则是为生物大分子多肽以及蛋白质的分离，分析而设计。SymmetryShieldRP18内嵌极性官能团色谱柱，由于在靠近硅胶表面的极性官能团的存在，增加了硅胶表面的水分子浓度，改善了与水之间的浸润状况;因此可以允许使用极高水相作为分离，分析条件，而不会出现孔隙内去湿现象，对于分析碱性等大极性分析物而言，减少其保留能力，改善峰形，具有很高的方法重现性。此外，SunfireSilica色谱柱则是纯粹的高纯硅胶柱，作正相使用。Sunfire以及Symmetry系列色谱柱是Waters比较早期一些的色谱柱，均使用高纯度硅胶作为固定相基质，对其表面键合之后，再进行封端处理；相较与HPT第一代颗粒杂化技术而言，对于极性化合物特别是碱性化合物的分析能力就显得比较弱一些。此外，其pH允许范围为2-8，相比采用HPT技术的Xterra系列色谱柱（pH允许范围1-12），对于pH的耐受性比较差一些。Figure3WatersXTerracolumnfamilyXterra系列色谱柱，采用第一代颗粒杂化技术（HPT），使用超纯四乙氧基硅氧烷与甲基三乙氧基硅氧烷作为起始物料合成甲基聚乙氧基硅烷，使得高纯度硅胶的每三个硅羟基就有一个被甲氧基化，再次交联与封端处理后，其表面硅羟基量减少了30%左右，且在合成杂化颗粒的同时完成封端，具有很高的批次重现性。因此，对于pH的耐受性得到了极大的提高，可耐受pH1-12。C18与RP18载碳量分别为15.5%与15%，RP8与Phenyl载碳量为13.5%与12%，粒径可选3um，5um以及10um（制备用）。C18，RP18，RP8载碳量与高纯硅胶基质Symmetry以及Sunfire保持一致，但对于极性化合物的分离，分析而言，明显提高其峰形对称性与分析方法重现性。Phenyl色谱柱的加入，则是对C18以及C8烃基配体的一个显著补充，可提供不同于C18以及C8的选择性，特别适合含有苯环、萘等苯共轭结构的分析物，在疏水与氢键作用之外，还能与分析物起到pi-pi相互作用，对一些难分离样品（特别是医药）可实现高效，快速分离，分析。其聚合物特性，质地与硅胶相比略软，具有耐压能力略弱，柱效相应略低的缺点。Figure4aWatersXBridgecolumnfamilyFigure4bWatersXBridgecolumnfamilyFigure4cWatersXBridge-XPcolumnfamilyXBridge色谱柱家族是Waters液相色谱柱的当家花旦，采用最新一代颗粒杂化技术（BEH），使用超纯四乙氧基硅氧烷与双（三乙氧基甲硅烷基）乙烷作为起始物料合成聚乙氧基硅烷。与第一代杂化颗粒技术（HPT）相比，机械强度得到很大提高，Si之间额外的二乙氧基链接桥，使得该类型色谱柱的耐受低pH能力得到进一步提升（pH1-12）。其中，最常用的是三键键合的XBridgeC18，C8，Phenyl柱，均采用封端处理，载碳量有所增加，分别为18%，13%，15%；单键键合TMS封端处理的ShieldRP18，载碳量17%，粒径范围覆盖分析到制备。酰胺柱的加入，有益于对极性化合物的分离，可明显改善峰形，而不用使用离液序离子或者离子对试剂。PeptideC18130埃，300埃以及C4300埃色谱柱用于对多肽以及蛋白质类生物制品进行分离与分析。OligoC18用于对单糖，寡糖样品进行分析。BEH技术XBridgeXP系列色谱柱，与XBridge相比，差别在于粒径为2.5um，可轻松实现HPLC与UPLC之间方法的有效转换。Figure5aWatersXSelectcolumnfamilyFigure5bWatersXSelect-XPcolumnfamilyXSelectCSH色谱柱与XBridge色谱柱相比，区别在于前者固定相表面带有低密度的电荷，可增强对于带电化合物的保留能力，提高对化合物的载样量以及提供对称的峰形。其中五氟苯基柱在提供不同于C18，Phenyl柱的选择能力的同时，增大极性化合物的保留。HSS型色谱柱，采用聚合物杂化颗粒，使用超纯四乙氧基硅氧烷单体进行聚合，得到纯度极高的合成硅胶。其中HSST3，HSSSB，HSSPFP，HSSCN色谱柱，为极性化合物的分离提供了多样化选择，其中T3采用低密度封端技术，后三种则不采用封端处理。XSelectXP色谱柱，与XSelect相比，差别在于粒径为2.5um，实现HPLC与UPLC之间方法的有效转换。Figure6WatersCORTECScolumnfamilyCORTECS色谱柱固定相使用实心球技术，相比其他类型色谱柱具有快速分离，背压较低，柱内扩散较低的特点，也具有载碳量不足，载样量低的缺点。实际使用量远不如其他类型的液相色谱柱。Figure7WatersAtlantiscolumnfamilyAtlantis色谱柱固定相使用高纯度硅胶作为固定相基质，对硅羟基进行特殊封端处理（裸露硅羟基适量但不完全封端）。选择性C18链采用低密度键合，T3采用三键键合的方式，对低pH的耐受性得到增强，dC18色谱柱采用双键键合方式。其最大特点是在RP模式下，完全100%兼容纯水相作为流动相，特别适合于增大极性分析物的保留时间。此外，HilicSlica色谱柱为亲水硅胶色谱柱，同样兼容100%水相，其使用方法与分离原理与经典RP色谱具有一定的区别。选择合适的液相色谱柱是分析方法开发成功与否的关键，实际应用过程中可根据待分析样品的极性与非极性大小，复杂程度，待分析样品中各种组分的结构相似程度，分析方法开发的目的，选择合适的色谱柱。ReferenceWaterscolumnmannual更多更新内容，请关注微信公众号药物分析与工艺分析或搜索Pharma_Analytical或扫描下方二维码，交流请加微信号Lindaring001。