《生物药剂学与药物动力学实验》教学大纲

《生物药剂学与药物动力学实验》教学大纲一、课程基本信息课程编号：2中文名称：生物药剂学与药物动力学实验英文名称：ExperimentofBiopharmaceuticsandpharmacokinetics适用专业：药物制剂专业课程类别：必修开课时间：第6学期总学时：24总学分：1二、课程简介（字数控制在250以内）生物药剂学是研究药物及其剂型在体内的吸收、分布、代谢、排泄过程，阐明药物的剂型因素，机体生物因素和药物疗效之间相互关系的一门学科；药物动力学是应用动力学原理与数学处理方法，定量描述药物在体内动态变化规律的学科。生物药剂学与药物动力学是药学专业的一门主要专业课程。使学生在掌握生物药剂学和药物动力学的基本概念、基本理论和研究方法基础上，能初步应用有关知识正确评价药物制剂质量，设计合理的剂型、处方及生产工艺，并为临床合理用药提供科学依据，也能应用药物动力学的原理进行药物制剂生物等效性评价、给药方案设计及临床药物治疗方案的个体化等。三、相关课程的衔接生物药剂学作为药剂学的分支学科，两者互为关联，药物动力学作为一门新兴学科，为生物药剂学提供了理论基础和研究手段。生物药剂学与药理学和生物化学等学科，在内容上互相补充和渗透，都是研究药物及其他生理有效物质与机体的关系，但侧重点不同。药理学主要研究药物在体内的作用方式和作用机制，生物化学主要研究药物与体内的生化过程。预修课程（编号）：药剂学、药理学并修课程（编号）：四、教学的目的、要求与方法（一）教学目的掌握生物药剂学的研究方法和药物动力学参数计算。（二）教学要求实验课是生物药剂学与药物动力学课程中必不可少的重要实践环节。通过实践教学，学习生物药剂学与药物动力学实验的设计及数据的处理方法，熟悉生物样品处理与检测的方法，能进行临床药代动力学实验的设计及数据的处理，掌握实验方法在临床合理用药方案设计中的应用，掌握专业实验技能，培养学生独立思考和独立工作能力以及科学的工作态度和习惯。（三）教学方法以动手操作和综合设计实验为主，锻炼学生的实验动物操作能力、样品处理能力以及结果处理和计算能力。五、教学内容（实验内容）及学时分配实验一磺胺类药物的组织分布实验一、实验要求1.了解磺胺类药物紫外分光光度法测定原理2.通过实验了解药物的体内分布二、实验原理药物在体内分布是指药物经吸收进入体循环后，通过血液和各组织的膜屏障转运至各组织的动态过程。药物分布决定于组织的血流量、药物对脂膜的扩散速度及药物与蛋白质的结合程度。药物要分布到药理作用靶部位才能发挥药效药物。但如果药物在某组织出现蓄积则可能产生毒性作用，所以一般药物的分布可以为药效学和安全性评价提供重要信息。通过组织分布研究，可以了解试验药物在实验动物体内的分布规律、主要蓄积器官或组织及蓄积程度等。组织分布实验通常通过给药后，于一定时间取出各组织或器官，经前处理后，用适宜的方法测定其中药物的含量。磺胺噻唑钠为对氨基苯类化合物，在酸性溶液中可使苯环上的氨基(－NH2)离子化生成铵类化合物(－NH3+)，进而与亚硝酸钠起重氮反应，产生重氮盐。此重氮盐可在酸性溶液中与显色剂胺类化合物(N-1-萘乙二胺)起偶联反应，形成紫红色的偶氮化合物。利用该呈色反应，采用分光光度法可测定出给药后不同时间不同组织中磺胺类药物的浓度。三、实验步骤1.标准曲线的制作取大鼠3只，断颈处死，收集血液至肝素化离心管中，并立即取出肝脏、肾脏及脑组织，用生理盐水冲洗干净后立即用滤纸吸干，精确称量组织重量，按1∶6加生理盐水（脑组织按1∶3）置玻璃匀浆器中进行研磨，研磨后将匀浆液倒入离心管中，3000r/min离心10min，取上清液1ml按1∶1加20%三氯醋酸沉淀蛋白，3000r/min离心10min，取上清液待用。血液经3000离心10min后取上层血浆待测精密吸取沉淀蛋白后不同组织的上清液2ml（以2ml蒸馏水代替上清液，其他操作同样品处理，为空白对照）各6份于干净试管中，加入磺胺噻唑钠标准溶液使肝脏、肾脏组织液中药物浓度为0.1、0.25、0.5、1、5、10g/ml，脑组织液中药物浓度为0.05、0.1、0.25、0.5、1、5g/ml，再各加入0.5%亚硝酸钠溶液0.05ml，混合，静置3min后，各加入0.5%氨磺酸铵溶液1ml，摇匀2min后加显色剂（0.05％二盐酸N-1-萘乙二胺）2ml，摇匀。5min后用分光光度计于540nm处测定吸收度。2.组织分布实验取大鼠3只称重，按100mg/kg尾静脉注射10％磺胺噻唑钠注射液。于给药后5、20、120min时，处死大鼠，立即取出肝脏、肾脏及脑组织，用生理盐水冲洗干净后立即用滤纸吸干，精确称量组织重量。余下操作除不加标准液外，其他同标准曲线制作项下处理后，测定不同时间、不同组织中的药物吸收度。代入相应标准曲线，计算不同时间中各组织中ST的浓度。四、实验结果1.各组织标准曲线方程2.各组织中药物浓度组织时间（min）A浓度C(g/ml)组织中药物量（g/g）肝520120肾520120心脏520120脑520120血520120五、问题与讨论1.磺胺噻唑钠在大鼠肝脏、肾脏、心脏及脑组织的分布有何异同？2.组织分布研究有何临床意义？实验二血浆蛋白结合率测定一、实验要求1.掌握平衡透析法测定血浆蛋白结合率的原理和方法。2.掌握血浆蛋白结合率在临床药动学中的意义。二、实验原理药物进入血液后一部分与血浆蛋白结合，称之为结合型药物，未结合的药物称之为游离型药物。通常结合型与游离型处于动态平衡状态。药物与血浆蛋白结合符合质量作用定律，即：D+PPD(1)]][[][21PDPDkkK(2)式中D为游离药物浓度，P为血浆蛋白浓度，PD为结合型药物浓度，k1和k2分别表示结合常数和解离常数。K为平衡时的亲和力常数。在实际工作中通常用血浆蛋白结合率来反映药物与血浆蛋白亲和力的大小，即：%100][][][PDDPD血浆蛋白结合率血浆蛋白结合率是反映药物分布的重要参数。常用的测定方法有平衡透析法(equilibriumdialysis)和超滤法(ultrafitration)等。平衡透析法原理平衡透析法是利用与血浆蛋白结合的药物不透过半透膜的特性进行测定。此方法是将血浆蛋白置于一个隔室内，用半透膜将它与另一个隔室分开，另一隔室为缓冲液。此半透膜可以让系统中游离的药物自然透过，而不能让蛋白质等大分子物透过（如下图所示）。平衡透析法的原理示意图平衡时，两室的游离药物浓度相等。测定两室药物浓度，就可以计算相应的血浆蛋白结合率，计算公式如下：1k2k100%CCC212血浆蛋白结合率式中C1和C2分别为血浆室和缓冲液室中药物浓度，其中血浆室药物浓度也可通过加入药物浓度与游离药物浓度换算得到。三、实验步骤1.半透膜处理用50%乙醇将醋酸纤维膜加热煮沸1小时，再用50%乙醇加热煮沸1小时后，用0.01mol/LNaHCO3溶液煮沸1小时，加热水洗3次，用水浸泡过夜。2.透析试验将水杨酸标准品加入空白血浆中，使水杨酸血浆浓度分别为l00g/ml、200g/ml，400g/ml、600g/ml，每个浓度5份。将浸泡好的管状透析袋除去袋内外水分，一端用线扎紧，保证不漏。加入配好的水杨酸血浆2ml，折叠并扎紧袋口，使袋内保留少量空气，使透析袋悬浮在缓冲液中，不至沉底。将两端结扎的透析袋放入装有8ml透析液20ml试管中，用袋两端残留线段调节袋内外液体，使保持同一水平，排除因液面差引起液体流动。把试管放到摇床上平衡透析24h，整个系统在37℃恒温水浴中进行。达到平衡后，吸出袋外透析液少许，加等量3％三氯醋酸试剂，检查有无血浆蛋白漏出，如有漏出，则该样本弃用。取袋外溶液测定水杨酸浓度，计算蛋白结合率。3.水杨酸浓度测定1）标准曲线制备精密称取于105℃干燥至恒重的水杨酸对照品20mg，用蒸馏水溶解、稀释并定容于100ml量瓶中作为储备液，精密量取适量，用透析液稀释至浓度分别为5、10、25、50、100、200g/ml标准系列溶液，用透析液作空白，在296nm波长处测定水杨酸的吸收度。以吸收度A为纵坐标、水杨酸浓度C为横坐标，进行线性回归，求回归方程。2）样品浓度测定以不加药物血浆的透析液为空白，测定不同浓度药物血浆透析液中水杨酸的吸光度，代入标准曲线计算游离药物浓度。四、实验结果1.将标准曲线数据列表，并求出回归方程水杨酸浓度（g/ml）5102550100200吸收度A回归方程2.血浆蛋白结合率测定加入的血浆浓度（g/ml）透析液A游离药物浓度（g/ml）结合药物浓度（g/ml）血浆蛋白结合率（%）100200400600五、问题与讨论1.测定血浆蛋白结合率有何意义？2本实验有何不足，可如何改进？实验三氨茶碱药物动力学的研究一、实验目的1.掌握紫外分光光度法测定氨茶碱的血药浓度，求算有关药动学参数二、实验原理由于氨茶碱有效血药浓度范围较窄，一般为10～20μg/ml，故有必要进行临床监测。在酸性条件下，血清中的茶碱可用有机溶媒萃取出，并同时沉淀血清蛋白，再用碱夜把茶碱自有机溶媒中萃取出，然后进行紫外测定，采用双波长测定法，分别测定在波长274nm和298nm处的吸收度。三、实验内容1.氨茶碱标准曲线的绘制：取氨茶碱标准品，精密称量以0.1mol/LNaOH溶液配成500mg/L的贮备液。另取试管5只，各加入0.5ml空白血清，然后依次加入上述贮备液4.0μl、8.0μl、12μl、、16μl、20μl，各加入0.1mol/LNaOH溶液至4.0ml，其浓度分别为0.5μg/ml、1.0μg/ml、1.5μg/ml、2.0μg/ml、2.5μg/ml的标准液。按血药浓度测定法处理，用紫外分光光度计在波长274nm及波长298nm处测定吸收度（0.1mol/LNaOH溶液作参比）。2.血药浓度的测定：取血清样品0.5ml置试管中，加0.1mol/L盐酸溶液0.2ml，5％异丙醇－氯仿液5ml，振摇混合，离心（2500r/min）10min。吸取氯仿液（上层）4.0ml置于另一试管中，加入0.1mol/LNaOH溶液4.0ml，混匀，离心10min，吸取碱液（上层）3～3.5ml，用紫外分光光度计，测定碱液在波长274nm和波长298nm处的吸收度。3.药动学实验设计：选用雄性家兔称重，按10mg/kg剂量给药，以5％葡萄糖溶液稀释氨茶碱注射剂10倍，由耳静脉给药（2min内注完）。然后分别于0.25h、0.5h、1h、2h、3h、4h、6h、8h取血约2ml（另一耳静脉取血）。分离血清（试管不涂肝素，静置，离心2000rpm），备用。依法测定血药浓度。四、实验结果1.绘制标注曲线根据测定的吸收度计算△A，即△A＝A274-A298。列表，求出标准曲线回归方程。表1氨茶碱标准曲线数据试管号12345C(μg/ml)A274A298△A回归方程2.将测定的血药浓度测定数据填于表2，根据标准曲线计算样品的血药浓度。表2血清样品中氨茶碱浓度0.250.51.01.523468T(h)A274A298△AC(μg/ml)3.将表2中数据以半对数作图，得到血药浓度－时间图。按二室模型处理方法，求出α、β、A、B等参数。思考题：做好本次实验的关键是什么？在操作中应注意哪些问题？六、作业（报告）撰写实验报告。七、课程考核以平时表现与实验报告书写相结合的考核方式。八、教材及主要参考资料（注明是否规划教材或获奖教材，参考资料控制在10项以内。）1.刘建平,李高.生物药剂学与药物动力学（第四版）.北京.人民卫生出版社.2012年5月2.林宁.生物药剂学与药物动力学.北京.中国中医药出版社.2011年3月执笔人签名：王少兵教研室主任签名：葛月宾教学院长审核签名：