重组克隆的筛选和鉴定讲义

重组克隆的筛选和鉴定讲义内容提要第一节载体表型选择法第二节DNA电泳检测法第三节核酸杂交检测法第四节免疫化学检测法第五节转译筛选法第六节真核重组基因的选择方法一般克隆与筛选策略第一节载体表型选择法根据载体提供的表型进行选择的方法：抗生素抗性基因的插入失活选择法-半乳糖苷酶的显色反应选择法一般原理一种利用抗生素抗性基因或其他基因的插入失活，来筛选重组子的方法。通常外源DNA插入的位点设计在特定基因上，一旦外源DNA插入，该基因就被破坏而失去活性。由此来判断载体上是否带有外源DNA。一、插入失活法的原理二、利用抗生素抗性基因：pBR322以pBR322为例，说明利用抗生素抗性基因的插入失活的原理。1.原理在pBR322上有多个单一的限制酶位点，如BamHI位点，恰好在一个四环素抗性基因内。如果有外源DNA插入BamHI位点，那么涉及四环素抗性的基因就损坏，因此，带有重组pBR322质粒的细胞，仍对氨苄青霉素有抗性，但对四环素的抗性消失（敏感）。2.筛选的方法①转化细胞涂布于含有氨苄青霉素的固体培养基上，并培养至菌落出现。②用一个牙签接触培养基的表面，将沾有不同菌落的牙签，放到另一含有四环素的固体培养基表面接触一下。③适温培养，有的克隆生长，有的不生长。④根据不会生长的位置，再回到带氨苄的培养基上去找那些原始的克隆。⑤这些克隆因为丧失了对四环素的抗性，就是含有重组pBR322质粒的重组子。图pBR322的结构图3.抗菌素标记的选择（1）Ampr氨苄青霉素抗性基因产生-内酰胺酶。酶使氨苄青霉素变为青霉酮酸。青霉酮酸使蓝灰色的碘-青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）褪色。Ampr有PstI、ScaI等多个插入位点。（2）四环素抑制细菌生长，但不杀死细菌。（3）环丝氨酸杀死生长的细菌，但不杀停止生长的细菌。4.选择的过程（1）四环素抗性插入失活如果在Tetr上插入外源DNA，导致四环素抗性基因失活，可用四环素﹢环丝氨酸的平板，选择重组克隆。Tetr插入失活的细菌，其生长可被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；Tetr不失活的细菌，能抗四环素，正常生长，但可被环丝氨酸杀死。无环丝氨酸图四环素抗性插入失活重组克隆（2）氨苄青霉素抗性插入失活氨苄青霉素抗性基因编码产生-内酰胺酶。酶使氨苄青霉素变为青霉酮酸。青霉酮酸使蓝灰色的碘-青霉素指示液褪色。如果Ampr上插入外源DNA，导致氨苄青霉素抗性基因失活，就不能使碘-青霉素指示液褪色---呈蓝灰色。据此选择阳性克隆。图氨苄青霉素抗性插入失活三、利用-半乳糖苷酶显色选择重组子的原理1.-半乳糖苷酶与LacZ基因由E.colilac操纵子上的LacZ基因编码。分解乳糖生成葡萄糖和半乳糖。2.LacZ基因突变的LacZ基因，只编码-半乳糖苷酶的部分肽段（氨基端）。2.培养基中IPTG、X-gal的作用（1）IPTG作用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷是诱导物，可诱导lacZ基因的表达-半乳糖苷酶。（2）X-gal作用5-溴-4-氯-3-吲哚--D-半乳糖苷。作为-半乳糖苷酶水解的底物。（3）X-gal的显色反应β-半乳糖苷酶(四聚体)将X-gal水解成半乳糖苷和蓝色的吲哚衍生物(靛蓝)。在4℃蓝色加深。-互补作用是pUC质粒载体的特性。pUC载体：含有LacZ基因，编码-半乳糖苷酶的部分肽段（片段，氨基端）。受体菌：基因组中带有突变的-半乳糖苷酶基因（缺失片段），可被IPTG诱导表达（只编码-半乳糖苷酶的-肽）。载体和受体菌基因组互补：只有当受体菌吸收了带有LacZ基因的pUC质粒，才能合成完整的有活性的-半乳糖苷酶。3.-互补作用氨苄青霉素抗性基因LacZ基因：编码-半乳糖苷酶的部分肽段。LacZ上有插入外源DNA的MCS位点。pUC18/19的结构图利用蓝白斑法筛选pUC8/9重组子，是一种直接检测-半乳糖苷酶活性的方法。①先将转化子涂于含有氨苄青霉素的培养基，能合成-半乳糖苷酶。②然后再通过检测-半乳糖苷酶的活性，来选择重组子，如果既能抗氨苄青霉素，又能合成-半乳糖苷酶的细胞，就是重组子细胞。4.筛选的方法：蓝白斑法③-半乳糖苷酶分解X-gal的显色反应很灵敏。当在含有氨卡青霉素、X-gal、IPDG的培养基中，那些能合成完整的-半乳糖苷酶的非重组子克隆，会因它能分解X-gal而变成蓝色；④而重组子克隆因LacZ基因被破坏，不能合成完整的-半乳糖苷酶，故不能分解X-gal而呈白色。5.选择培养的原理在含有X-gal和IPTG的选择培养基上，载体上没有插入片段的转化子为蓝色菌落，而携带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落。平板37℃培养后，放于冰箱3-4小时，可使显色反应充分，菌落为蓝色。图-半乳糖苷酶显色反应*-半乳糖苷酶乳糖半乳糖葡萄糖X-gal半乳糖5-溴-4-氯靛蓝++蓝色图LacZ插入外源DNA图白色菌落与蓝色菌落的挑选四、pBS重组质粒的筛选实验使用的载体为pBS质粒。转化受体菌为E.coliDH5α菌株。由于pBS上带有Ampr和lacZ基因，故重组子的筛选采用Amp抗性筛选与α-互补现象筛选相结合的方法。载体α-供体为羧基末端缺失的β-半乳糖苷酶。如pUC、pGEM系列载体。菌株α-受体为氨末端缺失的β-半乳糖苷酶。如DH5α(LacZ△M15)、JM101~110(LacZ△M15)等。1.抗性筛选因pBS质粒带有Ampr基因，而外源DNA片段上不带该基因，故转化受体菌后，只有带有pBSDNA的转化子，才能在含有Amp的LB平板上存活下来；而只带有自身环化的外源DNA片段的转化子则不能存活。此为初步的抗性筛选。2.lacZ基因的插入失活pBS质粒上带有β-半乳糖苷酶基因的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。该编码区有一个多克隆位点，但并不破坏lacZ的阅读框架，不影响其正常功能。3.DH5α菌株E.coliDH5α菌株带有β-半乳糖苷酶的C端的部分编码序列。在各自独立的情况下，pBS和DH5α编码的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在pBS和DH5α融为一体时，可形成具有β-半乳糖苷酶活性的蛋白质。4.α-互补现象lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性突变体之间实现互补的现象。由α-互补产生的Lac+细菌较易识别，它在生色底物X-gal存在下，被IPTG诱导，形成蓝色菌落。当外源DNA片段插入到pBS质粒的多克隆位点后，导致读码框架改变，表达蛋白失活，产生的肽段失去α-互补能力。因此，在同样条件下，含重组质粒的转化子，在生色诱导培养基上，只能形成白色菌落。α互补作用/现象当pUC质粒转化LacZ基因的氨基未端编码序列缺失的Lac-指示菌株时，能恢复β-半乳糖苷酶活性，从而在含IPTG和X-gal的平板上，分解X-gal成5-溴-4-氯靛蓝，出现蓝色菌落的现象。当外源DNA插入pUC的MCS时，α-互补作用被破坏，在IPTG和X-gal平板上则不显蓝色而出现白色菌落。第三节DNA电泳检测法PFGE从转化后的克隆（转化子）中快速抽提重组质粒，琼脂糖凝胶电泳比较其分子量大小。插入外源DNA的重组质粒分子量大，没有插入外源DNA的质粒分子量小。比较不同质粒在凝胶中的迁移率，迁移快慢不同，即可选出重组子。一、直接电泳检测法Marker载体重组图琼脂糖凝胶电泳图谱的比较已知未知二、酶切产物电泳筛选法1.原理根据已知的外源DNA序列的限制性酶切图谱，选择1~2种内切酶切割质粒，电泳后比较DNA带数和长度。或用一种内切酶切下插入片段，再用另一种酶酶切这个片段，电泳后比较两者是否符合预计的结果。图酶切产物的电泳筛选图限制性内切酶酶切图谱图表型筛选加酶切筛选０AATTAATT三、PCR扩增检测法1.原理在模板序列上扩增出预期DNA片断。2.过程（1）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。（2）用插入的DNA片段的引物作PCR。（3）PCR产物电泳检查。（4）PCR产物的长度是否与外源基因一致。第四节核酸的分子杂交核酸杂交技术由Hall、Nygaard等于70年代建立，应用DNA或RNA探针，与靶序列在溶液中杂交，检测固定在硝酸纤维素（NC）膜上的核酸序列的技术。核酸杂交法利用标记的核酸探针，与转化细胞的DNA进行杂交，可以直接筛选和鉴定目的序列克隆。常用的方法：将转化后生长的菌落，复印到硝酸纤维膜上，再用碱裂细菌菌落，释放的DNA就吸附在膜上，再与标记的核酸探针温育杂交，核酸探针就结合在含有目的序列的菌落DNA上。该技术已广泛应用于基因的表达、基因定位、克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列检测、遗传病疾病的诊断及生物分类等方面。一、核酸分子杂交的基础1.变性与退火DNA以双链形式存在，在进行分子杂交时，先将双链DNA分子解聚为单链，这一过程称为变性。两条单链通过碱基互补，聚合成稳定的双链区的过程称为退火或复性。2.同源序列不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序，即某种程度的同源性，就可形成杂交双链。分子杂交可在DNA与DNA（Southernblot）、RNA与DNA（Northernblot）或RNA与RNA（Insitu）的二条单链之间进行。3.分子杂交法分子杂交是通过一定方法，将核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性标记的探针与被固定的核酸分子杂交，经显影后，显示出目的DNA或RNA所处的位置。分子杂交就是将一种核酸单链用同位素或非同位素标记成为探针，再与另一种核酸单链进行杂交。4.探针经过同位素或非同位素标记的已知序列的寡核苷酸。单一的已知序列的寡核苷酸探针，能与它们的目的序列配对，可以准确地设计杂交条件，以保证探针只与目的序列杂交而不与序列相近的非完全配对序列杂交，对于一些未知序列的目的片段则无效。5.杂交的灵敏度和特异性核酸分子杂交具有高度的灵敏度和特异性。可以根据所使用的探针的已知序列，进行特异性的靶序列检测。二、探针的类型根据核酸的性质，可分为：DNA探针、RNA探针、cDNA探针和寡核酸探针。根据是否使用放射性标记物，可分为：放射性标记探针和非放射性标记探针。根据是否存在互补链，可分为：单链和双链探针。根据放射性标记物掺入情况，可分为：均匀标记和末端标记探针。1.双链DNA探针双链DNA探针的合成方法主要有两种：①切口平移法。②随机引物合成法。2.单链DNA探针单链DNA探针主要有两种合成方法:①以M13载体衍生序列为模板，用Klenow片段合成单链探针。②以RNA为模板，用反转录酶合成单链cDNA探针。3.末端标记DNA探针以Klenow片段标记3’末端为例说明末端标记的方法。4.寡核苷酸探针利用寡核苷酸探针可检测到靶基因上单个核苷酸的点突变。常用的寡核苷酸探针主要有两种:单一已知序列的寡核苷酸探针许多简并性寡核苷酸探针组成的寡核苷酸探针库。三、探针的标记方法与选择1.探针标记的方法①缺口平移法②DNA快速末端标记③T4多核苷酸激酶标记DNA5’末端法④随机引物延伸法⑤聚合酶链反应法。2.标记方法的选择根据实验的要求如灵敏度和显示方法等，选择合适的标记方法。①一般放射性探针比非放射性探针的灵敏度高。②在检测单拷贝基因序列时，应选用标记效率高、显示灵敏的探针标记方法。③在对灵敏度要求不高时，可采用保存时间长的生物素探针技术，或比较稳定的碱性磷酸酶显示系统或过氧化物酶系统。四、分子杂交1.常用的核酸杂交方法①Southern印迹杂交（Southernblot）②Northern印迹杂交（Northernblot）③菌落原位杂交（Colonyinsituhybridization）④组织原位杂交（Tissueinsituhybridization）等。⑤点杂交（Dotb