液相色谱基础知识B

Waters中国有限公司培训中心液相色谱教程(一)液相色谱基础知识B©2004WatersCorporationHPLC分离原理公式与术语ƒ这是一张由仪器提供的表示分离状况的色谱图ƒ这张色谱图含有丰富的信息ƒ现在我们来测量色谱图并以此对一些基本理论展开讨论©2004WatersCorporation洗脱体积和峰宽ƒ这些是导出理论和定义所必需的基本测量V0=无保留化合物的洗脱体积,等于一个柱体积V1=化合物1的洗脱体积V2=化合物2的洗脱体积W2=化合物2的峰宽(以体积计)©2004WatersCorporation分离度(R)的定义式ƒ简单说来,分离度即是两峰相对于其峰宽分开得有多远©2004WatersCorporationR:分离程度的量度ƒ此处是几个计算分离度的实例()2112WW21ttR+−=()8.5.5211-5tR1-3=+=()2.5.5211-2tR1-2=+=t0t1t2t3时间.5125©2004WatersCorporation容量因子(K′):保留能力的量度ƒk′是样品与填料作用强度的直接量度V0V1V2V3时间.51253.5.5-2k'2==0V0V1Vk'1−=:公式1.5.5-1k'1==9.5.5-5k'3==©2004WatersCorporation分离因子(α):峰分离程度的量度ƒα是两个化合物在同一套色谱系统上保留差异的数值表述0V1V0V2V1k'2k'−−=α=α或3.5-1.5-2==α12/的峰峰9.5-1.5-5==13/α的峰峰V0V1V2V3时间.5125©2004WatersCorporation理论塔板数(N):分离效率的量度ƒ理论塔板数或柱效是一个数值,它表示作为保留时间函数的峰展宽的量度1600N.5516NWV16N22===100N2516NWV16N22===PW=.5PW=2©2004WatersCorporation分离度方程式()κ′+κ′α−α=1N141R分离因子柱效容量因子ƒ分离度方程式描述了分离度与选择性,柱效和容量因子之间的关系ƒ它是评价一张色谱图以及决定如何解决、开发和优化分离方法的依据©2004WatersCorporation分离度方程:容量因子项ƒ若κ′=1,2,10或20,R会如何变化?()α−α=′κ+′κ1N141R©2004WatersCorporation分离度与k′的关系k′值k′项k′分离度?00011/2.5022/3.6733/4.751010/11.912020/21.95k′k′理想范围?分离度©2004WatersCorporationƒ若α=1.1或1.4,R会如何变化?分离度方程:分离因子项()κ′+κ′=α−α1N41R1©2004WatersCorporation分离度与α的关系0.290.09=−==−=−4.114.14.11.111.11.11ααααƒ当α值很小时,其很小的改变也会引起较大的分离度变化,当α值很大时此项接近1.©2004WatersCorporation分离度方程:柱效项ƒ若N增加2倍或3倍,R会如何变化?α−α1141Nκ′+κ′=R©2004WatersCorporation分离度与N的关系ƒ分离度与理论塔板数的平方根成正比()%NN结果塔板数变化73%54.730003000N41%44.720002000N31.610001000N↑==↑====73%122.415,00015,000N41%10010,00010,000N70.75,0005,000N↑==↑====©2004WatersCorporation影响峰宽的因素ƒ峰宽因其影响信噪比和分离度而显得很重要ƒ为了研究塔板数和保留对峰宽的影响,我们把塔板数表达式改写为峰宽随保留和塔板数而改变的形式==21r2rNV4WWV16N改写为©2004WatersCorporation峰宽与保留体积的关系ƒ这张峰宽对保留的曲线图清楚地显示其线性关系10002000300040005000保留体积(µl)50100150200250300N=5000峰宽(µl)©2004WatersCorporation峰宽与塔板数的关系ƒ峰宽与柱死体积以及k′的关系可用另一个式子表达()()2100r21rNk1V4Wk1VV,NV4W′+=′+==得代入则由若,©2004WatersCorporation峰宽与塔板数的关系2000400060008000050100150200250300k′=2,Vo=1000µL峰宽(µL)塔板数©2004WatersCorporation不对称因子(As)ABAs=4.4%峰高ABƒ不对称因子常用于测定峰拖尾ƒ不对称因子可用多种方法测定此处所示是典型的一种©2004WatersCorporation峰拖尾对分离度的影响11.21.41.61.82012345ƒ若不对称因子由1变为1.4,则柱效,N,必须增加1倍才能保持分离度不变0NN10%的不对称©2004WatersCorporation等板高度(HETP)的定义HETP=柱长/塔板数=L/N(HETP=HeightEquivalenttoaTheoreticalPlate)©2004WatersCorporation范第姆特(VanDeemter)方程ƒ范第姆特(VanDeemter)方程能够推导出流动相的线速度对给定峰的等板高度(H)的影响.线速度=++=µµµµµµCBAH其中:A项:叫作涡流扩散项,与填料的颗粒度及其分布和填充技术相关B项:叫作轴向(纵向)扩散项,与流速有关C项:叫作传质阻力项,与填料颗粒度和流速有关©2004WatersCorporation范第姆特(VanDeemter)方程ƒ范第姆特(VanDeemter)方程的另一种表达形式：©2004WatersCorporationVanDeemter曲线ƒ这条曲线表明随着流速的改变A,B,C三项对H的影响ƒ最上面的虚线是其综合效应12CAB线速度(µ)HETP0369©2004WatersCorporation塔板数与H和L的关系ƒ现在我们重新定义HETP–变为理论塔板数的方程式–以便研究影响理论塔板数的因素LNH=因为LHN=所以©2004WatersCorporation塔板数关系式(Knox方程)的推导ƒ我们使用基于Giddings的折合参数修正的VanDeemter方程ƒ这些修正给出用填料颗粒度和流动相的折合速度描述的塔板数()()v.05v2vdLNhdLN.05vvvh,Ddv,dHhHETP,31pp31mpp++==+===则由于范第姆特方程的吉丁斯修正折合线速度折合µ2+ƒ由此式可知:填料颗粒度dp越小,N越大；流动相流速V越高,N越大©2004WatersCorporation影响塔板数的因素ƒ用折合速度代入,我们得到塔板数与柱长,溶剂速度,填料颗粒度以及在流动相中的扩散速度的关系式.05mpm31mppmpDd2DDddLNDdv2µµµµ++==折合速度其中:Dm:扩散系数,dp:填料颗粒度，L：柱长，μ:溶剂线速度,V:折合速度©2004WatersCorporation塔板数与流速的关系塔板数x310123456789101112131415051015ƒ塔板数对线流速的曲线图流速(cm/min)©2004WatersCorporation线速度与流速的换算0.70.150.0411.40.30.0722.80.60.1344.20.90.2065.51.20.2887.01.50.3410流速4.6mmID流速2.1mmID(mL/min)流速1.0mmIDmL/min线速度mm/secu(mm/s)2.1x20mm,1.7µm2.1x20mm,2.5µm2.1x20mm,5µm024681012140.0002.0004.0006.0008.00010.00012.000HETP(µm)UPLC™RangeLC/MS“Narrow-bore”