双萤光素酶报告基因技术

ReportSmartly－萤光素酶报告基因技术自然界的萤光发光海星发光甲壳虫发光真菌发光节虫自然界的萤光发光鱼发光甲虫自然界的萤光萤火虫报告基因的作用•细胞信号转导途径•启动子/增强子•受体结合•病毒/细胞相互作用•转录因子•药物诱导作用或”效果”荧光-Fluorescence萤光-LuminescenceFireWormLuminescencevs.Fluorescence萤光（Bioluminescence）荧光（Fluorescence）是化学发光（Chemilumi-nescence）的一种，激发能量来自化学反应吸收来自光源的光，再发射另一光子萤光发光计（Luminometer）荧光计（Fluorometer）液闪仪（ScintilationCounter）电荷耦合装置光学成像系统（CCDopiticalimagingsystem）荧光显微镜各种报告基因的优点和缺点报告基因优点缺点萤光素酶•优越的灵敏度–高信号值–无内源活性•需要底物ß-gal•灵敏度好•细菌，血清等内源活性高•需要底物GUS（葡糖醛酸糖苷酶）•灵敏度好•植物中内源活性低•90%的E.coli,人／动物细胞中有内源活性•酶的扩散可引起“过度报告”•需要底物SEAP（分泌性碱性磷酸酶）•分泌性报告基因(不需裂解)•在HeLa,癌和其它细胞类型中有高的内源活性•需要底物CAT（氯霉素转乙酰基酶）-真核细胞没有背景表达-易于使用-设备现成(液闪仪,层析)•放射性的•灵敏度底•50ｈ半衰期GFP（绿色荧光蛋白）•显微镜:亚细胞定位•不需底物•背景可能高•折叠“情形”可导致信号差别萤光素酶报告基因的主要优点•非放射性•检测快（比CAT等）•灵敏度高（可比CAT检测灵敏度高100倍）•半衰期短（在理想条件下，可检测到10-20摩尔的萤光素酶分子。在哺乳动物细胞中半衰期3小时，在植物细胞中半衰期3.5小时。而CAT在哺乳动物细胞中的半衰期约50小时）•线形范围广（在10-16M(10pg/L)至10-8M(1mg/L)范围内,光强度与萤光素酶浓度成正比）•一般比显微镜检测的荧光更灵敏(对多孔板而言)•生物萤光比荧光更稳定,因为自然界进化的酶能保护光子发射器•通过基因工程可以延伸生物萤光的性能和能力萤光素酶报告基因的使用•原理:–制备含有luc/Rluc的DNA–转染–提供刺激–测量萤光调节序列Luc２在活细胞中做报告基因检测外界刺激(导引物)萤光素酶基因蛋白质折叠调节序列加工转录转录因子信号转导翻译反义RNA受体蛋白-蛋白相互作用RNA酶病毒感染和增殖RNAi抑制启动子/增强子分析“碰撞启动子”:1)全序列:2)逐步缺失:Promoterluc+LightPromoterluc+LightPromoterluc+FireflyandRenilla萤火虫生物萤光的化学萤光素+ATP+O2萤光素酶Oxyluciferin+AMP+PPi+CO2+Light萤光素酶:单体,61,000Daltons辅-底物:ATP.Mg2+萤光素:Mg2+海肾萤光素酶反应Coelenterazine+O2萤光素酶Coelenteramide+CO2+Light萤光素酶:单体,36,000Daltons萤光素:(Coelenterazine)EnzymestructuresFireflyRenilla为什么要使用双报告基因报告基因A(首要信号)报告基因B(第二信号)特异生物学反馈+非特异生物学反馈非特异生物学反馈检测结果比较首要与第二信号确定特异生物学反馈•细胞可能有内源脱乙酰基酶-Gal或GUS活性.•CAT,-Gal和GUS检测是终点检测.•不能同时对在一个管中组合了萤光素酶和CAT,或-Gal,的两个报告基因的检测都灵敏而快速．传统的双报告基因的缺点双萤光素酶报告基因系统比用CAT和ß-Gal做内对照的优点•速度–样品不需预处理，不需孵育。两次检测在几秒种内完成•灵敏–两个萤光素酶的线性范围超过7个酶浓度数量级。内源萤光素酶背景极低•方便–一管完成检测，样品不必分份实验质粒对照质粒用海肾萤光素酶作对照归一实验变化归一反应=对照的（海肾萤光素酶)实验的(萤火虫萤光素酶)萤火虫萤光素酶海肾萤光素酶用两个萤光素酶做报告基因（萤火虫+海肾）数据处理举例第一天萤光素酶活性(RLU)比率归一的活性样品处理重复ＦＲ（F:R)变化倍数对照１5,1282,511２7,5533,815３10,5555,4137,7453,9131.981.00处理Ａ１5,13764,467２40,7123,574３88,7877,6546,02925,23211.525.82处理B1587,6355,1442988,3478,8323409,8813,564661,9545,847113.2157.18第二天对照１15,52920,4330.76２21,89730,8410.71•10,76013,6200.7916,06221,6310.741.00处理Ｃ１850,23920,843２578,95114,830３943,87321,788791,02119,15441,3055,81处理D114,86519,3-0528,96712,284313,76720,24612,53317,2780.730.99Δ活性倍数(F/R)样品=F/R)对照第二天处理Ｃ计算如下：Δ活性倍数(791,021/19,154)=（16,062/21,631)=55.81GloMax™20/20SingletubeluminometerGloMax™96luminometerWhitemicroplatesforluminescencePromega公司出品的双报告基因实验产品•质粒–萤火虫萤光素酶质粒–海肾萤光素酶质粒–叩头虫萤光素酶质粒•检测系统–非均质双报告基因检测系统（通量较低）–均质的双报告基因检测系统（适合高通量，自动化）载体-萤火虫萤光素酶载体•pGL3家族pGL3-BasicpGL3-ControlpGL3-EnhancerpGL3-PromoterpGL3-BasicMappGL3-ControlMappGL3-EnhancerMappGL3-PromoterMap•辅助报告基因的相对萤光单位(RLU)•启动子交叉交谈或互相干扰•实验刺激给辅助报告基因的不必要的调节内对照载体可能存在的问题载体-海肾萤光素酶报告基因载体第二代第一代phRL-nullpRL-nullphRL-TKpRL-TKphRL-TK(int-)phRL-SV40pRL-SV40phRL-CMVpRL-CMVphRG-BphRG-TKRenilla萤光素酶载体系列内含子T7启动子CMV即时早期增强子/启动子phRL-CMVHSVTK启动子phRL-TKSV40晚poly(A)SV40早期增强子/启动子phRL-SV40MCSphRL-nullhRL基因TK启动子phRL-TK(Int-)MCSphRG-B合成poly(A)信号转录停止位点三个读码框的终止密码子phRG-TK合成poly(A)信号转录停止位点三个读码框的终止密码子TK启动子hRL基因SV40晚poly(A)Renilla萤光素酶载体系列用萤火虫和海肾两个萤光素酶做报告基因•Dual-Luciferase®双萤光素酶报告基因系统（非均质检测）–E1910，100次–E1960，E1980，1000次•Dual-GloTM萤光素酶检测系统（均质检测）–E2920，10ml–E2940，100ml–EE2980，10X100ml均质检测与非均质检测发光细胞+培养基添加试剂细胞+培养基除去培养基发光清洗细胞裂解细胞添加试剂均质检测非均质检测Dual-Luciferase®报告基因检测系统组分•检测缓冲液II•底物（冻干粉）•Stop&Glo®缓冲液•Stop&Glo®底物,50X•被动裂解液,5XDual-Luciferase®报告基因检测步骤•裂解细胞–被动裂解•除去培养基..PBS洗..加1XPLB,振荡15分钟..检测–主动裂解•除去培养基..PBS洗..在1XPLB中刮下细胞..细胞转移到试管或小瓶中..1-2次冻融..检测•检测双萤光素酶检测方案1支试管2步检测30秒钟LuciferaseAssayReagentIIPassivelysisbufferStop&GloReagentDLRTMForHTSDLR™双报告基因检测系统应用举例α－黑色素刺激激素(α-MSH)对由人酪氨酸酶启动子／增强子控制的萤光素酶的表达的诱导(PromegaeNotes)•目的：监测细胞对α-MSH诱导的应答•材料：实验载体：pGL3-Try14A:人酪氨酸酶启动子／增强子＋Luc(+)阳性对照：pGL3-Control阴性对照：pGL3-Basic内对照：pRL-SV40B16-F1细胞（鼠黑素瘤细胞系CRL-6323)DLR™双萤光素酶检测试剂盒•步骤前一天：接种细胞，六孔板X3第二天：共转染：pGL3-Try14A和pRL-SV40（分成两组）pGL3-Control和pRL-SV40pGL3-Basic和pRL-SV40裂解细胞，测量萤光Dual-Glo™萤光素酶检测系统检测特点•均质检测，为高通量检测而设计•萤光信号稳定，2hrs内检测•自发萤光低于检测水平Dual-GloAssay:同一样品中检测两种萤光信号–Stableluminescencesignalsforbothreporters(t1/2~3.5hrs.)–10,000-foldsignalseparationbetweenthefireflyandRenillabioluminescencePrimaryreporter:FireflybioluminescenceSecondaryreporter:RenillabioluminescenceCellsinculturemediumAddfireflyassayreagentAddcombinationfireflyquenchreagent&RenillaassayreagentDual-Gloassay-选择性淬灭萤火虫萤光SelectivequenchoffireflyluminescenceDual-Glo™萤光素酶检测系统试剂盒组成•Dual-Glo™萤光素酶缓冲液•Dual-Glo™萤光素酶底物（冻干粉）•Dual-Glo™Stop-Glo®缓冲液•Dual-Glo™Stop-Glo®底物操作步骤•试剂制备简单–将Dual-Glo™萤光素酶缓冲液倒入Dual-Glo™萤光素酶底物中–用Dual-Glo™Stop&Glo®缓冲液按1:100稀释Dual-Glo™Stop&Glo®底物–所有的缓冲液存于室温,所有的底物存于–20°C•两步加入试剂:加,读,加,读•10,000倍信号分离(淬灭)用两个萤光素酶做报告基因Chroma-LucTM载体Chroma-Glo®检测试剂E.Coli表达的Chroma-LucTM基因Chroma-LucTM基因和载体三个基因:1.CBRluc–发红光的萤光素酶2.CBG99luc–发绿光的萤光素酶99.0%DNA相同于CBRluc3.CBG68luc-发绿光的萤光素酶68.9%DNA相同于CBRluc两种载体骨架:1.对照–置换了pGL3-Control的luc+(pCBR-Control,pCBG68-Control,andpCBG99-Control)2.Basic–置换了pGL3-Basic的luc+(pCBR-Basic,pCBG68-Basic,andpCBG99-Basic)合成的Chroma-LucTM萤光素酶载体骨架ControlBasicEnhancerChroma-LucTM基因SV40启动子SV40增强子SV40增强子(合成的或天然的基因)Chroma-LucTM基因Chroma-LucTM基因Chroma-Glo™检测的化学Luciferin+ATP+O2Lucifer