9DNA多态性及其分析技术解析

DNA多态性及其分析技术王文君广州中医药大学免疫研究室和分子生物学技术实验室第九章第一节多态性概述•一.定义•不同种的生物以及同一种生物的不同个体之间都存在着许多差异，称为生物的多态现象，即生物的多态性（polymorphism）。•生物群体中个体间的变异有的是由环境因素，如营养、气候等造成的；有的则是由遗传因素造成的。由遗传因素造成的变异形成一系列的多态性，称为遗传多态性（geneticpolymorphism）。•二.标准•发生遗传分离的基因座位（locus）具有两个以上等位基因时，其最常见的等位基因的频率不超过0.95或0.99时，这个基因座位就被认为具有多态性。在某些时候，一个基因位点上只由一个基因占据，但有时这个位置上缺乏这一基因，这时就会出现“有”和“无”两种情况，被称为二态性（dimorphism）。•三.分类•遗传多态性主要可分为遗传表型的多态性和DNA的多态性两大类。•由遗传控制表现出来的性状就是遗传表型。•检测遗传表型多态性有其局限性：•①遗传表型的多态性只反映出编码基因的部分变异。后者只占人基因组总DNA的10%（＜10%）。基因及基因相关序列占总DNA的25%。•②DNA序列中的同义突变不会引起表型的改变。这时检测表型就不能发现编码基因中存在的变异。•③基因的表达会有变异，基因型完全相同的生物体在不同的生长条件下可能有不同的表型，靠检测表型多态性来推断基因有时会出现错误结论。•分析DNA的多态性才能真正深刻地揭示生物的多态性。人类基因组序列概况人类基因组30亿碱基对非基因序列70%～80%基因及相关序列20%～30%编码序列＜10%中度或高度重复序列20%～30%单一数或低拷贝序列70%～80%簇状重复60%第二节DNA多态性的分类•DNA是遗传信息的物质基础，因而是反映个体间差异的最本质东西。DNA序列组成的个体特异性主要表现为下列类型的DNA多态性。•一.基因多态性•由于控制性状的基因碱基组成上的不同造成的多态性。•采用等位基因特异性探针（ASO或SSO探针）或限制酶切消化进行分析。•如人类白细胞抗原（HLA）系统，编码HLA-DR抗原的位点有超过200个等位基因。•二.重复序列多态性•串联重复序列多态性（variablenumbersoftandomrepeats,VNTR）：•①相同的核心序列，不同的个体重复的次数不同。•②不同的重复序列，其核心序列的组成会不同。•③在核心序列之间，不同的个体间会存在有无插入小段DNA或插入的片段长短不同的差异。•因此，两个无关个体的VNTR的变异能达到完全个体特异的程度，这是DNA指纹形成的基础。•中度重复的散在重复序列多态性。•遍布哺乳动物基因组中•三.性染色体多态性•X染色体的重复序列多态性•Y染色体的特异性片段多态性。•四.线粒体的DNA多态性•人线粒体DNA的D环•两个无关个体间，完全相同的可能性只有0.27%。第三节DNA多态性分析技术•一.RFLP分析技术•基本原理•限制性酶切片段长度多态性技术（restrictionfragmentlengthpolymorphism，RFLP）：用某种特定的限制性内切酶消化不同的DNA片段，由于DNA的碱基组成不同，就会产生不同长度的酶切片段。这样采用合适的限制性内切酶消化待分析的DNA片段，就能根据切出来的片段是否长度一致来推测其DNA序列是否相同，然后用标记好的相应的DNA探针与这些片段进行杂交，显出的图谱就可以反映出基因组DNA碱基序列组成是否存在差异。这一技术的基础是通过核酸的限制性酶切片段长度多态性来揭示DNA碱基序列组成的不同。抽提DNA（从血或组织）培养细菌人工合成探针限制性内切酶消化琼脂糖凝胶Southern转移、固定质粒纯化纯化探针标记探针（同位素或非同位素）预杂交杂交洗膜反射自显影或显色后分析结果RFLP技术图解•RFLP技术的基本步骤•一.靶DNA的准备•先将人基因组DNA抽提出来，选用合适的限制性内切酶酶解基因组DNA，将酶解出来的具有各种长度的DNA片段在琼脂糖凝胶上电泳分离，使其按片段的长短排列，将DNA片段变性后转移至硝酸纤维素膜或尼龙膜上（称为印迹转移，即Southernblot），并固定在这些载体上面。•二.核酸探针的标记•将准备作为探针的DNA片段纯化，用同位素（如32P）或非同位素标记，经纯化后使用。•三.杂交显示•将标记好的探针与硝酸纤维膜或尼龙膜上的单链DNA杂交，洗膜以后进行放射自显影或加入酶的反应底物显色，再对显示出来的谱带进行分析。•影响RFLP的几个因素•一.限制性内切酶•影响RFLP图谱的重要因素。•市售常见的有100多种。•星号*活性即非特异性酶解活性。反应液中甘油、乙醇浓度及被酶解DNA的质量和浓度。•二.核酸探针•不同的DNA探针会显示出不同类型的RFLP图谱。•1.基因探针•人基因组中某一基因的一个片段。•常用于研究人类遗传性疾病。•影响RFLP的几个因素•2.随机探针•从人基因组DNA中随意挑选出一个DNA片段，其功能并不知道。•采用统一的命名法：D后为来源之染色体的号码，S为单拷贝（NF代表有多个片段），最后是分配给定的序号。如D14S1等。•可进行疾病基因连锁分析。•3.重复序列探针•基因组中的重复序列，可同时揭示整个基因组中许许多多位点的DNA序列的多态性。•如1985年，Jeffreys等发现的高度重复的小卫星DNA探针，可揭示人类的DNA序列的多态性，并且在无关个体之间这类多态性相同的机会极微（只有3×10－11），称为DNA指纹。•可用于个人识别和亲子鉴定，人类学的研究。•4.人工合成的寡核苷酸探针•探测人基因组中的散在重复序列，也可用于个体特异性研究。•5.动物基因组的一段DNA片段•用于研究昆虫等动物，可用此作为探针进行相关研究，进行种、群分类。•注意事项•1.首先检测对象的DNA分子必须保持大分子。•在抽提DNA过程中避免人为地将DNA分子机械性切割成小片段的DNA，否则最终的结果可能是一种假象。•2.在用限制性内切酶消化大分子DNA时，要使DNA被完全消化，否则也会出假结果。•3.被消化的DNA浓度不能太高。•4.电泳时要低压电泳。•5.杂交前探针必须充分变性。•6.要根据探针标记的情况以及探针与靶DNA间序列互补的程度和GC含量来掌握洗膜的条件。•7.作放射自显影时，要根据探针标记的放射比活性以及靶DNA的量等因素决定曝光的时间。•Jeffreys等从人的染色体DNA中分离出一种重复序列作为探针，对人的染色体DNA进行RFLP分析（称为DNA指纹图）。•他们将总DNA用限制性内切酶完全酶解以后，用放射性的探针进行Southern印迹，每个人的DNA所产生的阳性杂交条带都是特异性的，而且子女的阳性杂交带中，有一半与父亲的DNA阳性杂交带相同，另一半是与母亲的阳性杂交带相同。用这种重复序列作为探针，对不同的人的DNA进行指纹分析，产生完全相同的图谱的机会小于60亿分之一。可用于法医鉴定、血缘关系的识别等。•这一实验方法所提供的证据已于1988年得到英国法庭的认可。•人的DNA指纹分析示意图•子女DNA指纹图中分别与其父、母的DNA指纹中相应的分子杂交条带相对应父子女母•二.PCR分析DNA多态性•基本原理•PCR分析DNA多态性的应用•1.分析基因多态性•反向点印迹杂交技术：将等位基因特异性探针（ASO探针）加poly(dT)尾巴，打点固定在硝酸纤维素膜上。将扩增产物与之杂交，显色反应后判读。•2.分析扩增DNA的RFLP（Am-RFLP）•DNA扩增（长）限制性酶切琼脂糖电泳分析•3.分析扩增片段长度的多态性•DNA的PCR扩增产物琼脂糖电泳分离分析•4.分析扩增DNA片段序列的多态性•对DNA扩增后进行序列分析。•不对称PCR•ssDNA•测序分析比较•5.随机引物PCR法分析DNA的多态性•RAPD是随机扩增多态性DNA(randomamplifiedpolymorphicDNA)的英文缩写。该法最初是由Williams等发明，其方法是用随机序列的9～10个核苷酸的引物，对基因组的DNA进行PCR扩增，再进行电泳分离。•采用任意顺序的引物扩增基因组DNA，可以在完全不知道特定DNA顺序的情况下分析其多态性，不仅可用于个人识别，还可用于其它各种遗传学研究。•有人建议把通过随意引物扩增的DNA顺序，称为RAPD标记，用于比较两种不同的生物的基因有否区别。•由于所有的RAPD都是显性的，所以无法区别扩增的DNA片段是来自杂合子还是纯合子。目前已有明显的迹象显示，RAPD标记具有广阔的应用范围和前景。•不但可用于基因制图，动植物培育，DNA指纹分析，而且在染色体特异DNA片段的分离鉴定、杂交细胞系或遗传原种中大段染色体的缺失或重复的筛查等诸方面也将发挥出重要作用。•其优点表现在以下几个方面：•①可以用一系列的通用引物分析不同种类的生物。•②可用于制备探针和分析未知的DNA顺序。•③由于每一个RAPD标记对应一种DNA顺序，可大大简化多种相关研究。•④RAPD技术有可能使基因型的鉴别自动化，高效基因制图等工作比应用RFLP和普遍PCR技术更有效，更简便。而且人工合成的随机引物可在实验空间进行交换，这比克隆DNA片段作为探针要容易和迅速得多，还免去了DNA分子杂交的麻烦。第四节DNA多态性分析技术的应用•1．研究人类遗传性疾病•人类某些遗传性疾病是因某一基因的碱基序列中发生突变，使之缺失了某一限制性内切酶的识别位点，因而使用此限制性内切酶无法切出与正常人相同大小的限制性片段来；另一些疾病则表现出相反的情况，出现了原来没有的某个限制性内切酶识别位点。有时是因插入了某一个片段引起疾病。•用PCR技术分析DNA多态性还可以进行产前诊断，对那些在婴儿期或少年期发病的严重影响病人劳动生活能力的遗传性疾病在胚胎期作出确诊，采取措施终止妊娠，对优生优育显得尤为重要。•2．建立人类基因组的遗传连锁图以及对某些有遗传倾向的疾病作相关性分析•3．作为遗传标记用于单卵双生或双卵双生的诊断，亲子鉴定、法医个人识别以及人类学的研究等。•4．直接作基因分型，特别是作HLA的基因分型，可用于器官移植、免疫学的研究。•5．检测异常的有丝分裂和减数分裂。•6．建立研究昆虫及其它动、植物新的分类方法。可用于物种鉴别。•7．某些传染性疾病的病原诊断也可以用PCR法分析某些病原体（如病毒和细菌）的特异性片段及其多态性达到目的。•8．对Y染色体DNA作多态性分析是父系遗传研究的有力工具。西红花及其伪冒品的RAPD指纹图1.Marker2.西班牙红花3.印度红花4.川红花5.莲须6.玉米须7.黄花菜•不同来源同种药材的RAPD指纹图•1.新鲜西洋参2.干品西洋参3.西洋参组织培养物•4.新鲜人参5.生晒参1（干品）6.生晒参2（干品）•诃子的种属鉴别（RAPD指纹图）•1.绒毛诃子2.诃子（云南）3.小诃子（广东）4.恒河诃子（广西）•5.银叶诃子6.大诃子（广东）7.毛诃子（云南）8.大诃子（广西）•9.小诃子（广西）10.大诃子（进口）11.小诃子（进口）