基因表达分析技术

A1基因表达分析技术METHODSFORANALYZINGGENEEXPRESSIONA2基因mRNA蛋白质多肽链基因表达A3一、通过检测mRNA揭示基因转录水平的表达特征根据分析方法的原理和功能特性，可将基因表达分析分为:封闭性系统研究方法:例如DNA微阵列、Northern印迹、实时RT-PCR等方法。只能研究已知的基因。开放性系统研究方法:如差异显示PCR、双向基因表达指纹图谱、分子索引法、随机引物PCR指纹分析等，可以发现和分析未知的基因。这里主要针对已知基因的常用表达分析方法做一介绍。A4（一）基于杂交原理检测mRNA的表达水平1．Northern印迹（Northernblot）※是一种基于RNA-DNA杂交原理建立的一种RNA分析技术※指将RNA变性及电泳分离后，并转移到固相支持物上，用杂交反应来鉴定其中特定mRNA分子的含量及其大小。A5三种印迹技术的比较A6RNA琼脂糖凝胶电泳3kb0.4kbNt36382604623Northernblothybridization28S18SA7分子杂交实验A8放射自显影照片目录A92．核糖核酸酶保护实验（ribonucleaseprotectionassay，RPA）是灵敏度和特异性很高的mRNA定量分析方法基本原理是将标记的特异RNA探针（32P或生物素）与待测的RNA样品液相杂交，标记的特异RNA探针与目的RNA结合，形成双链RNA，免受RNA酶的消化；而未结合的单链RNA经RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸。A10RPA基本程序：●待测RNA的分离●体外转录标记RNA探针●待测RNA与探针RNA进行液相杂交●RNA酶消化●不同大小杂交片段凝胶电泳分离A11核糖核酸酶保护实验原理示意图32P标记的探针：杂交双链进行变性PAGE，用放射自显影或磷屏成像系统检测探针的信号；生物素标记的探针：杂交双链经过变性PAGE后，电转移至尼龙膜，用链霉亲和素－辣根过氧化物酶和化学发光底物与膜上biotin标记的探针结合，X射线胶片或化学发光图像分析仪检测杂交信号。A12RPA比NorthernBlot的优势：•1.过量的探针与目的基因的杂交在液相环境完成，反应更加完全•2.RPA比NorthernBlot灵敏15－150倍，适合检测各种表达水平之基因•3.RPA通量高，同时检测多个基因，可评价他们在同一情况下的差异表达•4.一次RPA就能完成10多次NorthernBlot的工作，加快研究速度A13可细胞或组织中原位表达的mRNA进行区域定位标记探针特异性地与目标靶mRNA序列杂交，检测标记信号来确定基因在组织和细胞内表达的区位信息。可作为定量分析的补充。3．原位杂交（insituhybridization，ISH）A14原位杂交技术主要步骤：•材料处理及细胞样品的固定；•样品的制备和预处理；•探针的制备和预杂交；•探针及样品的变性；•杂交温育；•检测杂交信号，进行结果分析。A15（二）RT-PCR常用的mRNA检测方法1．反转录PCR可用于mRNA的半定量分析反转录PCR（reversetranscription-PCR，RT-PCR）它以mRNA为模板，体外扩增cDNA，再以cDNA为模板进行特定基因转录产物的PCR扩增。RT-PCR技术一般用于RNA的定性分析；如果设置阳性参照，则可对待测RNA样品进行半定量分析。反转录实时定量PCRA16逆转录酶ＤＮＡ聚合酶mRNAcDNA杂化双链PCR扩增A17PCR技术原理A185Primer15Primer2Cycle2Cycle1555555TemplateDNA55555555一、基本工作原理目录A19Cycle3555555555555555525～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。目录A20模板DNA特异性引物耐热DNA聚合酶dNTPsMg2+PCR体系基本组成成分A21PCR的基本反应步骤变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚CA22实验仪器电泳仪A23琼脂糖凝胶电泳槽A24PCR仪A25PCR反应•PCR反应条件•PCR过程•PCR的特点A26实验结果PCR结果。1、对照(无模板)；2－6、PCR产物（5ul样品）A27凝胶成像系统A28TargetAmplificationNo.ofNo.AmpliconCyclesCopiesofTarget122438416532664201,048,576301,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128AmpliconA29常规PCR方法的局限性分析：•无法对起始模板准确定量,只能对终产物进行分析•必须在扩增后用电泳方法分析,费时费力而且EB有毒•无法对扩增反应实时检测A302、实时荧光定量PCR（real-timePCR）A31非特异性的嵌入荧光染料（Non-specificDNAbindingdyes）–SYBR®GreenI–SYBR®Gold–EthidiumBromideA32Extension5’3’5’3’ExtensionContinuedApplyExcitationWavelength5’3’5’3’TaqTaq3’5’3’TaqTaqRepeatDNAbindingdyesBDBDBDBDBDBDBDBDBDBDlllllA33实时PCR技术原理目录A34非特异性的嵌入荧光染料评价•优点：与特异性的荧光探针相比价格便宜只需要设计PCR引物•缺点：由于它和模板的结合是非特异性的，它可以和所有的双链DNA包括引物和非特异性扩增产物结合，不能真实反映目的基因的扩增情况。A35TaqMan探针评价•优点：荧光信号强与其它探针相比设计简单可用于多通道检测可用于SNP的检测•缺点：比DNA结合染料价格高A36CtvalueandReal-TimeQuantitativePCRTheory•Ct值（ThresholdCycle）PCR扩增过程中，扩增产物荧光信号超过基线值（进入指数增长期）时的循环数。A37•模板起始浓度越高，Ct值越小•Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系Ct值与模板起始浓度的关系•如果模板浓度增加1倍，Ct值就提前1个循环到达•如果模板浓度减少1倍，Ct值就滞后1个循环到达A38CopyNumbervs.Ct-StandardCurvey=-3.3192x+39.772R2=0.9967051015202530354001234567891011Logofcopynumber(10n)Ct绝对定量可以得到某个样本中基因的拷贝数和浓度利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。A39A403、原位PCR技术A41原位ＰＣＲ原位聚合酶链式反应（InStillPCR,Is－PCR）是由Haase等于1990年首创。它是利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下,利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行ＰＣＲ扩增。可进行细胞内定位。适用于检测病理切片中含量较少的靶序列A4216块载玻片及24个0.2ml管的样品blockA43A44操作步骤1.细胞或组织固定：细胞经固定和乙醇通透化处理后便适于一般PCR试剂（包括引物和Taq酶）2.PCR扩增细胞内目的片段3.原位杂交检测扩增产物A.阳性对照B.阴性对照C.原位检测mRNA表达A45•DNA芯片(DNAchip)•cDNA芯片(cDNAchip)是指将许多特定的DNA片段或cDNA片段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上。4、基因芯片分析基因表达谱（高通量地分析基因表达）基因芯片(genechip)A46目录A47二、通过蛋白质检测揭示基因翻译水平的表达特征Western印迹（Westernblot）是一种免疫印迹技术，其基本原理与核酸分子杂交相似，只是以偶联标记物的抗体分子作为探针，检测转移到固相支持物上的蛋白质/多肽分子。当在蛋白质水平上检测特定基因的表达活性时，最常用的方法就是利用Western印迹对细胞或组织的总蛋白质中的特异蛋白质进行定性和半定量分析。（一）采用特异抗体经Western印迹可直接测定基因编码多肽A481.蛋白质样品的制备2.SDS-PAGE分离3.蛋白质转膜4.特异抗体（即第一抗体）与膜上的蛋白质（抗原）印迹杂交5.再经偶联了可检测标记信号的第二抗体（即抗抗体，商品试剂盒中多采用偶联辣根过氧化物酶的Ig）6.最后经与酶的底物反应而显影、成像，经扫描后获取免疫印迹信息Westernblot基本程序A49A50A51A52WestBlotA53受检标本+固相载体表面的抗原或抗体起反应——结合特异抗体（一抗）-------酶连接的第二抗体（也可预先包被抗体，“吸附”抗原），再进行酶-底物反应。反应后通过专门的酶标仪测定、记录数据。（二）酶联免疫吸附分析（Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）A54特点：1、具有特异性；2、灵敏度很高；3、稳定、操作简便，标本用量少，适于大规模筛查，尤其适用于检测体液中微量的特异性抗体或抗原；4、既可以做定性试验也可以做定量分析。酶联免疫吸附分析A55免疫组织化学（immunohistochemistry）是利用标记的特异性抗体通过抗原-抗体反应和显色反应，在组织或细胞原位检测特定抗原（即目标蛋白质）的方法，简称为免疫组化实验。近年来由于荧光标记抗体的广泛应用，这两种方法又被统称为免疫荧光法。（三）免疫组化实验对组织/细胞表达的蛋白质进行原位检测A56A57人皮肤角化细胞免疫荧光染色A58（immunofluorescence），可应用荧光（倒置）显微镜或激光共聚焦显微镜（confocalmicroscopy）对靶分子进行定性、定量和定位分析，激光共聚焦显微镜还可进行断层成像，是在蛋白质水平分析基因表达的直观方法。其中抗体对于蛋白质靶点的特异性、种间交叉反应、检测系统的灵敏性以及细胞或组织的固定类型是该方法的关键因素。运用双重着色或多重着色程序同时对多个感兴趣的靶分子进行检测，是一种揭示更多有关细胞群的功能和它们之间相互作用信息的有效方法。免疫组化主要是作为定性、定位的技术，若结合密度计量系统、图像分析系统等测量工具也可以得到定量的数据。A59流式细胞术（flowcytometry）在细胞水平分析特定蛋白质的基本原理也是抗原-抗体反应，它利用荧光标记抗体与抗原的特异性结合，经过流式细胞仪分析荧光信号，从而根据细胞表达特定蛋白质的水平对某种蛋白质阳性细胞（即特异基因表达的细胞）作出判断。（四）流式细胞术用于分析细胞特异表达的蛋白质A60流式细胞术可以检测活细胞，也可以检测用甲醛固定的细胞。广泛应用于细胞表面和细胞内分子表达水平的定量分析，并能够根据各种蛋白质的表达模式区分细胞亚群。此外，流式细胞术可以使用多个荧光标记的抗体同时对多个基因产物进行标记和监测，是对细胞进行快速分析、分选、特征鉴定的一种有效方法。A61是将具有高度亲和特异性的探针分子（如单克隆抗体）固定在基片上，用以识别复杂生物样品溶液中的目标多肽；蛋白质功能芯片可用来研究蛋白质修饰、蛋白质-蛋白质/DNA-蛋白质/RNA-蛋白质，以及蛋白质与脂质、蛋白质与药物、酶与底物、小分子-蛋白质等的相互作用（五）蛋白质芯片分析蛋白质表达谱（高通量地分析基因表达）蛋白质芯片(proteinchip)A62蛋白质检测芯片包括:1.抗体芯片2.抗原芯片3.配体芯片等A63目前比较和鉴定蛋白质表达谱更多采用双向电