分子荧光光谱

分子荧光光谱MolecularFluorescenceSpectroscopy一．概述二．荧光光谱的基本原理三．分子结构与测试条件对荧光光谱的影响四．荧光光谱的分析技术及应用荧光是指一种光致发光的冷发光现象。当某种常温物质经某种波长的入射光（通常是紫外线）照射，吸收光能后进入激发态，并且立即退激发并发出比入射光的的波长长的出射光（通常波长在可见光波段）；而且一旦停止入射光，发光现象也随之立即消失。具有这种性质的出射光就被称之为荧光。一．概述用荧光抗体染色之原生动物澳大利亚科学家最新发现，一种叫“螳螂虾”的海里动物通过发出色彩鲜艳的荧光来恐吓警告敌对者或者吸引性配偶。光致发光物体依赖外界光源进行照射，从而获得能量，产生激发导至发光的现象。它大致经过吸收、能量传递及光发射三个主要阶段，光的吸收及发射都发生于能级之间的跃迁，都经过激发态。灵敏度高检测限可达ppb量级（10-9）；荧光在各个方向上都有发射，因此可以在与入射光成直角的方向上检测；荧光不受来自激发光的本底的干扰，灵敏度大大高于紫外-可见吸收光谱，适合于痕量物质的检测。分子荧光光谱法的特点信息量较大荧光光谱能提供较多的参数，例如激发谱、发射谱、峰位、峰强度、荧光寿命、荧光偏振度等。紫外和可见荧光涉及的是电子能级之间的跃迁，荧光产生包括两个过程：吸收以及随之而来的发射。每个过程发生的时间与跃迁频率的倒数是同一时间量级(大约10-15秒)，但两个过程中有一个时间延搁，大约为10-8秒，这段时间内分子处于激发态。激发态的寿命取决于辐射与非辐射之间的竞争。由于荧光有一定的寿命，因此可以检测一些时间过程与其寿命相当的过程。二．荧光光谱基本原理荧光光谱是物质分子吸收紫外光后产生的分子发射光谱。1.光谱类型2.跃迁类型分子中原子的电子能级跃迁，伴随振动能级的跃迁。3.分子的激发与失活（1）分子的激发•基态→激发态(S1、S2、激发态振动能级)：吸收特定频率的辐射，跃迁一次到位。•激发态→基态：多种途径和方式，速度最快、激发态寿命最短的占优势。•单重态：一个分子中所有电子自旋都配对的电子状态。•三重态：有两个电子的自旋不配对而平行的状态。激发三重态能量较激发单重态低。①大多数有机物分子含有偶数电子，这些电子成对且自旋方向相反地存在于各个原子或分子轨道上。所以大多数分子在基态时处于单重态。②分子吸收光子并从基态跃迁到第一激发态或更高的激发态中的某个振动能级，分子仍处于单重态。持续一段时间后，激发态电子的自旋可能倒转，生成三重态.③单重态能级间的跃迁符合光谱选律，跃迁概率大。分子通过吸收辐射而直接被激发到三重态的跃迁是禁阻的，概率很小。（3）跃迁的方式与激发态分子失活：①无辐射跃迁•振动弛豫：由于分子间的碰撞，激发态分子由同一电子能级中的较高振动能级转至较低振动能级的过程，其效率较高。激发态分子常常首先发生振动驰豫。•内转换：相同多重态的两个电子能级间，电子由高能级回到低能级的分子内过程。•系间窜越：激发态分子的电子自旋发生倒转而使分子的多重态发生变化的过程。含有重原子的分子中（如I、Br等），系间窜跃最常见。•外转换：激发态分子与溶剂或其他溶质相互作用和能量转换而使荧光（或磷光）减弱甚至消失的过程。荧光强度的减弱或消失，称为荧光熄灭或猝灭。•磷光：•若第一激发单重态的分子通过系间窜跃到达第一激发三重态，再通过振动驰豫转至该激发的最低振动能级，然后以辐射的形式回到基态，发出的光线称为磷光。•由于激发三重态能量较激发单重态低，所以磷光的波长比荧光的波长稍长。•磷光仅在很低的温度或黏性介质中才能观测到。因此磷光很少应用于分析。②辐射跃迁•荧光：•受光激发的分子经振动驰豫、内转换、振动驰豫到达第一电子激发单重态的最低振动能级，以辐射的形式失活回到基态，发出荧光。•由于无辐射使分子吸收的能量有部分损失，因此荧光的能量比吸收的能量小，即荧光波长一般比激发光波长长。荧光产生的过程：任何荧光化合物都具有激发光谱(吸收光谱)和发射光谱(荧光或磷光光谱)两种特征光谱.4.激发谱与发射谱激发谱：荧光物质在不同波长的激发光作用下测得的某一波长处的荧光强度的变化情况，也就是不同波长的激发光的相对效率。发射谱：某一固定波长的激发光作用下荧光强度在不同波长处的分布情况，也就是荧光中不同波长的光成分的相对强度。激发光谱和发射光谱具有三个特点：⑴斯托克斯位移，波长：荧光＞激发光；⑵荧光光谱和激发光谱大致成镜像对称；⑶荧光发射光谱的形状与激发光波长无关。蒽的激发光谱和荧光光谱蒽(乙醇)的激发光谱和不同激发波长下的荧光发射光谱/nm荧光寿命(τf)：•除去激发光源后，分子的荧光强度降低到激发时最大荧光强度的一半所需的时间称为荧光寿命(10-8∼10-10s)。荧光物质受到一个极短时间的脉冲光激发后，荧光强度从激发态到基态的变化，可用指数衰减定律表示：Ft=F0e-Kt。•F0、Ft：开始时和t时的荧光强度，K为衰减常数。5.荧光寿命(τf)椐据Beer-Lambert定律可以推得荧光强度F：Fλ=2.3I0(A)C·l··Z式中(A)为激发波长A处的消光系数，Ｃ为样品分子的浓度，I0为入射光强度，I0为透过样品后的光强度，l为光程（样品池光径）5.荧光强度荧光产率()：又称为荧光量子产率、荧光效率。吸收激发光的光子数发射荧光的光子数荧光产率三．分子结构与测试条件对荧光光谱的影响（1）荧光与结构的关系•电子跃迁类型*→的荧光效率高，系间窜跃至三重态的的速率常数较小，有利于荧光的产生。•共轭效应含有*→跃迁能级的芳香族化合物的荧光最常见且最强。具有较大共轭体系或脂环羰基结构的脂肪族化合物也可能产生荧光。•平面刚性结构效应可降低分子振动，减少与溶剂的相互作用，故具有很强的荧光。如荧光素和酚酞有相似结构，荧光素有很强的荧光，酚酞却没有。取代基作用第一类取代基是给电子基团，能增加分子的电子共轭程度，使荧光效率提高，荧光波长长移。如：－NH2、－OH、－OCH3、－NHR、－CN等。第二类取代基是吸电子基团，会妨碍分子的电子共轭性，使荧光减弱甚至熄灭。如：－COOH、－NO2、－CO、－NO、－SH、－NHCOCH3、－X(卤素原子序数↑，荧光效率↓)等。第三类取代基对电子共轭体系作用较小，对荧光的影响不明显。如：－R、－SO3H、－NH3＋等。•取代基效应：苯环上有吸电子基常常会妨碍荧光的产生；而给电子基会使荧光增强。化合物相对荧光强度荧光波长/nmC6H6（苯）10270~310C6H5COOHC6H5NO230310~390C6H5CH3C6H5OHC6H5OCH3C6H5NH2C6H5CN1718202020270~320285~365285~345310~405280~360C6H5ClC6H5BrC6H5I750275~345290~380①内部因素•自猝灭—发光物质分子间碰撞而发生的能量无辐射转移。自猝灭随溶液浓度的增加而增加。•自吸收—荧光化合物的发射光谱的波长与其吸收光谱的波长重叠，溶液内部激发态分子所发射的荧光在通过外部溶液时被同类分子吸收，从而使荧光被减弱。•荧光强度F与光源的辐射强度I0有关，因此增大光源辐射功率I0可提高荧光测定的灵敏度。紫外-可见分光光度法无法通过改变入射光强度来提高灵敏度。（2）影响应该强度的因素②环境因素温度:温度对荧光的影响很大，温度降低会减少碰撞和非辐射失活的概率，因此会增加荧光强度。例如：荧光素的乙醇溶液在0℃以下每降低10℃，荧光产率增加3%，当温度降低至-80℃时，荧光产率为100%。化合物相对荧光强度C6H5OH18C6H5O—0C6H5NH220C6H5NH3+0pH值:含有酸性或碱性取代基的芳香化合物的荧光与pH有关。pH的变化影响了荧光基团的电荷状态，从而使其荧光发生变化。溶剂•溶剂极性增加，有时会使荧光强度增加，荧光波长红移。•若溶剂和荧光物质形成氢键或使荧光物质电离状态改变，会使荧光强度、荧光波长改变。•含重原子的溶剂（碘乙烷、四溴化碳）使荧光减弱，磷光增强。溶解氧•往往使荧光强度降低。四．荧光光谱技术分析与应用1.测量荧光的仪器主要由四个部分组成：激发光源、样品池、双单色器系统、检测器。I0IF•光源：最常用的是高压汞蒸气灯。发出的是较强的线状谱，其中365，398，436，546，579，690，734nm谱线较强。大多数荧光化合物都可以在一定波长范围内用不同波长的光诱发荧光，因此通常至少有一条汞线是适用的。高压氙灯发出的光线强度大，而且是连续光谱，克服了汞蒸气灯射线数目少、强度差别大的缺点。但氙弧灯热效应大，稳定性较差。高功率连续可调激光光源是一种新型荧光激发光源。激光的单色性好、强度大。激光光源近年来应用日益普遍。钨灯和氢灯发出的紫外光强度太小，在荧光中应用不多。•单色器：第一单色器——选择激发光波长λ1（＞250nm的紫外光），称为激发单色器。第二单色器——选择(测量)发射光（荧光）波长λ2，与激发光入射方向垂直，称为荧光单色器。•样品池：采用低荧光材料，通常为石英池。•检测器：光电倍增管。2.荧光法的应用：常规荧光光谱测试：（1）在紫外光区内，固定激发光波长（可以任意选择几个）对荧光物质进行荧光发射光谱的扫描，从而确定产生最大的荧光强度时的荧光波长λ2；（2）固定荧光波长λ2，对荧光物质进行激发光谱的扫描，确定最佳的激发光波长λ1。定量荧光光谱测试：①标准曲线法：配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度。②比较法：在线性范围内，测定标样和试样的荧光强度，再进行比较。•无机物能够直接产生荧光并用于测定的很少。可通过与荧光试剂作用生成荧光配合物、或通过催化或猝灭荧光反应进行荧光分析。非过渡金属离子的荧光配合物较多。可用于荧光分析的元素已近70种。•荧光试剂是具有两个或以上与Mn+形成螯合物的电子给予体官能团的芳香结构。OHNSO3NaN=NOHHOON8-羟基喹啉石榴茜素R无机物的荧光分析•无机化合物的分析：•铍、铝、硼、镓、硒、镁、稀土常采用荧光分析法；•氟、硫、铁、银、钴、镍采用荧光熄灭法测定；•铜、铍、铁、钴、锇及过氧化氢采用催化荧光法测定；•铬、铌、铀、碲采用低温荧光法测定；•铈、铕、锑、钒、铀采用固体荧光法测定。有机物的荧光分析•荧光法在有机化合物中应用较广。芳香化合物多能发生荧光。脂肪族化合物往往与荧光试剂作用后才可产生荧光。名称结构式应用9-蒽基重氮甲烷某些羧酸丹磺酰氯伯胺、仲胺、酚或氨基酸CH2N2N(CH3)2SO2Cl核壳荧光纳米颗粒在小白鼠体内的代谢研究，静脉注射RuBPY荧光纳米颗粒30min，5h，24h和96h后肾脏组织的光学和荧光成像。荧光光谱在生物与医学上的应用ab核壳荧光纳米颗粒与活细胞的生物亲和性研究HNE1细胞与二氧化硅壳荧光纳米颗粒的生物亲和性，连续培养10天，细胞传代四次。（a）没有吞噬纳米颗粒的细胞；（b）吞噬纳米颗粒的细胞。O157:H7大肠杆菌的成像(A)被识别的O157:H7大肠杆菌的SEM成像。(B)被识别的O157:H7大肠杆菌的荧光成像。A单个细菌的检测通过使用基于Ab-Ag反应标记的荧光纳米颗粒进行红斑狼疮(SLE)的诊断明视场光学图像荧光图像B疾病早期诊断吞噬了pH纳米传感器的小鼠巨噬细胞明视场光学图象荧光图象