Real-Time-PCR技术原理及常见问题

RealTimePCR技术原理及常见问题PromegaGoTaq®AmplificationFamily普洛麦格（北京）生物技术有限公司Promega(Beijing)BiotechCo.,Ltd电话：8008108133，01058256268中文网址：英文网址：目录1.End-Pointvs.RealTimePCR(终点法与实时荧光定量PCR）................................................................................12.实时荧光定量PCR原理........................................................................................................................................22.A探针法原理——FRET(FluorescenceResonanceEnergyTransfer，荧光共振能量转移)..........................22.B染料法原理——特异性与双链DNA结合的荧光染料.............................................................................33.RealTimePCR数据分析.........................................................................................................................................44.相对定量vs绝对定量.........................................................................................................................................54.A相对定量......................................................................................................................................................54.B绝对定量......................................................................................................................................................65.常见问题................................................................................................................................................................75.A荧光信号升高太高，超出检测范围：......................................................................................................75.B高浓度模板反而CT值更大甚至检测不到..................................................................................................75.C阴性对照有扩增...........................................................................................................................................85.D熔解曲线有2个或2个以上的峰..............................................................................................................95.EΔRn不超过1，在低水平徘徊.....................................................................................................................95.F扩增效率低于90%.....................................................................................................................................105.G扩增效率高于110%...................................................................................................................................105.H标准曲线R2小于0.98...............................................................................................................................101.End-Pointvs.RealTimePCR(终点法与实时荧光定量PCR）PCR是对特定的DNA序列的进行定性或定量检测最灵敏的方法之一。理论上来说，PCR反应过程中生成的DNA产物是呈指数方式增加的，即每增加一个循环，PCR产物加倍。但随着反应循环数的增加，产物积累、原料消耗，最终PCR反应无法继续维持指数方式的扩增，而进入线性期和平台期。整个PCR反应过程中，只有在指数期，PCR产物的量与加入的初始模板量存在明确的数学关系（PCR产物量=初始模板量×2N，N=循环数），因此，利用公式，可以由产物的量精确推算出初始模板量的多少。而在线性期和平台期，PCR产物量和初始模板量之间不存在准确的数学关系，由这两个时期的产物量来推算初始模板量的多少是不准确的。传统的PCR又称为终点法PCR，常用凝胶电泳的方法来检测PCR产物的量，并由此推断初始模板的含量高低。由于凝胶成像方法本身灵敏度的局限，终点法PCR只能检测反应平台期的产物量，得出的结论不可靠。而在实时荧光定量PCR（RealTimePCR）中，特殊荧光染料的加入，使仪器可以对整个PCR反应扩增过程进行实时的监测。因此可以在PCR反应处于指数期时，检测PCR产物的量，并且由此来推断初始模板的含量，结果更加准确。普洛麦格（北京）生物技术有限公司Promega(Beijing)BiotechCo.,Ltd电话：8008108133，01058256268中文网址：英文网址：实时荧光定量PCR原理实时荧光定量PCR所使用的荧光化学主要分为两种类型：荧光探针法和荧光染料法。2.A探针法原理——FRET(FluorescenceResonanceEnergyTransfer，荧光共振能量转移)荧光探针法是在PCR扩增时加入一对引物的同时加入一条特异性的荧光探针。该探针同样为一段oligoDNA，其结合的位点位于PCR上下游引物结合位点之间。探针两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，由于FRET效应，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。PCR扩增时，Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。普洛麦格（北京）生物技术有限公司Promega(Beijing)BiotechCo.,Ltd电话：8008108133，01058256268中文网址：英文网址：染料法原理——特异性与双链DNA结合的荧光染料染料法是在PCR反应体系中，加入过量荧光染料。该荧光染料只特异性地与双链DNA结合，并且处于游离态时不发射荧光，只有在结合DNA双链后才发射出荧光信号。随PCR循环数的增加，产物量的增多，产生的荧光信号逐渐增强，实现了荧光信号与产物量的关联。两种方法各有优缺点，基于探针的RealTimePCR优点是有引物和探针共同保证PCR反应的特异性，缺点就是需要额外设计探针，探针设计过程中要考虑Tm值与引物匹配、探针的结合位置、长度、GC含量等。并对探针进行两种染料（报告基团和淬灭基团）标记。在荧光标记之前最好先进行预实验，检测探针和引物能否进行成功的PCR。整个过程操作麻烦，探针价格昂贵。染料法与探针法相比优势就非常明显，不需要额外设计探针，简便易行。能成功进行普通PCR的引物，一般来说就可以直接用于染料法的实时荧光定量PCR，PCR的特异性可以通过测溶解曲线来监控，染料是预混在MasterMix中的，操作简单，价格便宜。普洛麦格（北京）生物技术有限公司Promega(Beijing)BiotechCo.,Ltd电话：8008108133，01058256268中文网址：英文网址：数据分析RealTimePCR实验完成后，通常可以得到以下三组数据：扩增曲线、标准曲线（只有采用标准品时才有）、溶解曲线（只有染料法才有）。对RealTimePCR结果进行分析，主要是研究此三组数据。扩增曲线（Amplificationcurve）：根据扩增曲线输出CT值标准曲线（Standardcurve）：根据标准曲线计算拷贝数与扩增效率熔解曲线（Dissociationcurve）：根据熔解曲线判断产物特异性普洛麦格（北京）生物技术有限公司Promega(Beijing)BiotechCo.,Ltd电话：8008108133，01058256268中文网址：英文网址：相对定量vs绝对定量4.A相对定量相对定量：确定目的基因在待测组中的含量与对照组相比升高或减低的倍数。其中，对照组未经过药物处理的对照，或处理时间序列中处理时间为0hr的样品点。待测组为需要观察药物作用的样品组或处理一定时间后的样品组。相对定量法实验设计简单，无需标准品DNA，无需建立标准曲线，以待测基因升高或降低的倍数来反映药物或处理方法对待测基因的影响。相对定量方法：2-ΔΔCT法。下图为实验流程图：2-ΔΔCT法数据分析：第一步，RealTimePCR扩增结束后输出对照组和待测组的目的基因及内参基因的CT值如下（表格中的数据仅作举例用）：CT值对照组（control）待测组（#1）待测组（#2）GAPDH21.1021.1021.10GOI(geneofinterest)33.3329.5625.93第二步，用内参基因的CT值归一化目的基因的CT值。计算ΔCT，ΔCT=CT(GOI)-CT(GAPDH)，结果如下：对照组（control）待测组（#1）待测组（#2）ΔCT12.238.464.8