36地中海贫血

二、地中海贫血的发病机理血红蛋白的构成血红蛋白由血红素和珠蛋白组成，每个珠蛋白含有四条肽链。每条肽链结合一个血红素，构成一个血红蛋白单体，人体血红蛋白分子就是4个Hb单体聚合成四聚体。由于珠蛋白链的合成在个体发育阶段有规律地演变，因此各种血红蛋白在人体发育的不同阶段，呈现不同的比例。αβγ出生-3-6365025HbF（α2γ2）初生占70%-75%6-12月2%逐渐达成人水平HbA（α2β2）初生占5%-10%6-12月占95%以上HbA2（α2δ2）初生1%12个月2%-3%δ地中海贫血的分子机制地中海贫血发生机制地中海贫血是由于珠蛋白基因缺失或突变导致某种珠蛋白链合成障碍，造成珠蛋白链合成失去平衡而导致的溶血性贫血。根据合成障碍的肽链不同可把地中海贫血分为α和β地中海贫血两大类，此外还有少见的δβ和γβ地中海贫血。地贫的分子基础RedBloodCellsRedBloodCells三、地中海贫血的主要类型α地中海贫血1、静止型α地贫：基因型为-α/αα临床上无症状，血液生化筛查无法检测到。2、标准型α地贫：基因型为--/αα或-α/-α临床表现可有轻度贫血，血液生化筛查可检测到3、血红蛋白H病：基因型为--/-α。临床表现为中至重度贫血，个体差异较大，常合并肝、脾肿大。生化筛查可以见到异常血红蛋白带。4、血红蛋白Bart’s病（胎儿水肿综合征）基因型为--/--，胎儿时期形成血红蛋白Bart’s（γ4），怀孕后期（6M后）出现胎盘肿大，胎儿全身性浮肿，常合并胸腔积液和腹水（民间称为“大肚仔”）。往往在孕后期或出生时死亡。β地中海贫血1、轻型β地贫：基因型为β/β°或β/β+临床表现可为轻度贫血，血液生化筛查可检测到2、重型β地贫：基因型为β°/β°或β°/β+四、地中海贫血的遗传方式α地中海贫血的遗传方式β地中海贫血的遗传方式地贫的遗传--SEA/αα--SEAαα--SEA/--SEA--SEA/αα--SEA/αααα/αα1/41/21/4--SEA/αα--SEAαα地贫的遗传--SEA/αα-α3.7/αα--αααα-α3.7--/-α3.7αα/αααα/-α3.7--/αα地贫的遗传654-п/β41-42/β654-пββ41-42/654-п654-п/β41-42/ββ/β41-42地贫的遗传--SEA/ααβ/βαα/αα41-42/β--SEAβααβααβ--SEA/αα41-42/β--SEA/ααβ/βαα/αα41-42/βαα/ααβ/βαα41-42五、一些地贫筛查方法的比较1、红细胞指数：红细胞平均体积（MCV）是一个常用的指标。80fl以下应疑为地贫，可用A2和HbF测定，判断是否为β地贫。MCV要用到血象自动分析仪，一般基层不易办到。2、红细胞的形态和直径分布曲线：在显微镜下观察包涵体、靶红细胞等形态异常的细胞，由红细胞的直径变化可测出直径分布曲线的异常。由于该方法较为繁琐，工作量大，因此不适合筛查。3、Hb电泳、柱层析和Hb自动分析仪：可筛查各种异常血红蛋白及做A2和HbF的定量检查，对β地贫的筛查适用。但分析仪器较为昂贵，且不能同时筛查α地中海贫血的遗传方式α地贫，所以其使用受到限制。4、红细胞脆性实验：地贫时，红细胞的脆性降低（抗低渗溶解的能力增强），因此可以作为筛查的指标，中山医科大学遗传室建立的“一管法”脆性试验，优点是简便、经济，易在基层推广。5、地贫的基因诊断，一般只用于对筛查出的高风险对象的进一步确诊和产前诊断。地贫的分子基础3个外显子、两个内含子IVS1IVS2α117149β130850α地贫由于α珠蛋白基因的缺陷导致α珠蛋白链合成障碍所引起的溶血性贫血。人类α珠蛋白基因（简称α基因）位于16号染色体上，每条16号染色体上各有2个控制α珠蛋白链（简称α链）合成的α基因，分别称为α1和α2。在我国南方各省，α地贫以基因缺失多见，约占α地贫的90-95%，称为缺失型α地贫。地贫的分子基础α地贫地贫的分子基础α地贫仅缺失一个α基因。患者可无临床症状血红蛋白各成分正常，红细胞形态正常，红细胞脆性检查等地贫筛查结果可正常，根据一般实验室检查结果难以发现，主要依靠基因诊断。两种基因型：①左缺失：-α4.2/αα；②右缺失：-α3.7/αα。地贫的分子基础静止型α地贫①左缺失：（-α4.2/αα）缺失一个包括α2在内的4.2kbDNA片段，②右缺失：（-α3.7/αα）缺失范围包括部分α1和部分α2在内的3.7kbDNA片段，剩下α1和α2的部分基因重新融合形成一个α基因。地贫的分子基础静止型α地贫也称轻型α地贫，患者缺失两个α基因。临床上可无贫血表现或只有轻微贫血，感染、怀孕时贫血加重，肝脾无肿大或只有轻度肿大。实验室检查有以下特征：红细胞形态轻度改变；MCV降低；红细胞渗透脆性降低；变性珠蛋白小体形成实验阳性。基因型：--/αα；-α/-α地贫的分子基础标准型α地贫--/αα（--SEA/αα）一条16号染色体上两个α基因均缺失，此型在我国南方最常见，占标准型α地贫的95%以上，也称为东南亚缺失型或α地贫1；-α/-α两条16号染色体各缺失一个α基因，称为α地贫2，基因型有：-α4.2/-α4.2-α3.7/-α3.7-α3.7/-α4.2地贫的分子基础标准型α地贫缺失三个α基因。HbH病患者出生时几乎无明显症状，随者年龄的增大，患者有轻度或中度的贫血，Hb含量在70-100g/L，多数伴有肝脾肿大及轻度黄疸。少数病情较重者，Hb含量可低至30-40g/L，并有骨骼变化及出现类似β地贫的特殊贫血面容，疲乏无力。感染、服用氧化性药物或抗疟疾药物、妊娠等均可使贫血加重。地贫的分子基础血红蛋白H病实验室检查可见：MCV、MCH、MCHC、Hb等降低，红细胞渗透脆性明显降低，Heinz‘s小体生成实验阳性，骨髓中红系细胞明显增多，有核红细胞中可见到HbH包含体，血红蛋白电泳可见HbH带。基因型有：--/-α3.7和--/-α4.2地贫的分子基础血红蛋白H病4个α基因全部缺失，基因型为（--/--）正常情况下，胎儿要合成胎儿血红蛋白HbF（α2γ2），由于Bart‘s水肿胎儿的α基因全部缺失，不能正常合成α链，过多的γ链形成四聚体（γ4）称为HbBart’s。HbBart‘s对氧亲和力非常高，跟氧结合后不容易分解，因此释放给组织的氧量大量减少，造成组织严重缺氧水肿，引起水肿胎、死胎或新生儿死亡。地贫的分子基础HbBart's胎儿水肿综合征非缺失型α地贫17种，我国常见有三种：①血红蛋白ConstantSpring(HbCS)，是由于α基因终止码发生突变，α链多出31个氨基酸，HbCS不稳定，易于降解；②血红蛋白QuongSze(HbQS)，是由于α2基因上一个密码子发生突变，产生的αQS影响了血红蛋白四聚体的形成，导致不稳定血红蛋白的产生；③多聚腺苷酸（PolyA）信号突变，使α链合成减少。地贫的分子基础突变型α地贫由于β珠蛋白基因的缺陷导致β珠蛋白链合成障碍所引起的溶血性贫血。人类β珠蛋白基因（简称β基因）位于11号染色体上，每条11号染色体上有1个控制β珠蛋白链（简称β链）合成的β基因。完全不能合成β链者称为β0地贫；能部分合成β链者（约为正常者的5-30%）称为β+地贫，此外还有δβ0地贫。在我国南方各省，β地贫以基因突变多见。临床分型大致可有4种主要类型：地贫的分子基础β地中海贫血患者是β+地贫、β0地贫、δβ0地贫的纯合子（β+/β+、β0/β0、δβ0/δβ0）或是β+和β0地贫的双重杂合子。这些患者的β链几乎不能合成，α、γ链相对增多，使HbF和HbA2比率升高。患儿一般在出生后4-6个月逐渐出现进行性加重的贫血，缺氧刺激骨髓的造血功能亢进，使红骨髓大量增生，骨质受侵蚀致骨质疏松，出现“地中海贫血面容”（头颅大，额顶及枕部隆起，鼻梁塌陷，上颌及牙齿前突，眼距宽，眼睑浮肿），要靠输血维持生命。地贫的分子基础重型β地贫患者为β+、β0、δβ0的杂合子（β+/βA、β0/βA、δβ0/βA）。这类患者还能合成相当量的β链，症状较轻，本病特点是HbA2升高（可达4-8%）或（和）HbF的升高。地贫的分子基础轻型β地贫编码区突变：有无义突变、移码突变等，使生成的mRNA稳定性降低或形成无功能的mRNA，从而影响β链的合成，多数产生β0地贫，少数为β+地贫。常见的有无义突变密码子17（A→G）、43（G→T）；移码突变41/42（-TCTT），71/72（+A）均导致β0地贫。非编码区IVS-1和IVS-2突变：影响了mRNA剪接等加工过程，形成异常mRNA，导致β0或β+地贫。常见有IVS-2654。此外还有，影响转录的突变：-29（A→G），-28（A→G）；血红蛋白E病HbE：26（G→A）等。地贫的分子基础β地贫基因型突变地贫的分子基础异常血红蛋白病1.HbEβ26（G→A）2.HbSβ6（谷→缬）黑人多见，血液粘度升高，血管容易梗阻，红细胞成镰刀形。心梗、一过性剧痛3.HbCβ6（谷→赖）纯合子表现轻度溶血性贫血伴肝脾肿大4.HbM（遗传性高铁血红蛋白症，常显）氨基酸的改变影响了铁原子与血红素的结合，铁呈高铁状态，携氧功能下降。α58（组→酪）β58（组→酪）β63（缬→谷）α87（组→酪）β92（组→酪）地贫的分子基础α地贫β地贫染色体16p1311p15主要异常缺失型点突变重型发病怀孕6月出生后4-6月实验室检查HbA2、HbF正常HbA2、HbF升高共同点贫血、易感染RBC脆性、MCV下降血红蛋白电泳可见异常带基因诊断的基本原理•ASO探针斑点反向点杂交技术首先合成正常和各种常见的突变的寡核苷酸探针对，分别与正常和突变序列完全互补，将探针固定在膜条上。进行杂交时，扩增产物将特异地与膜条上完全互补的序列结合，通过POD等显色后可清晰地看到杂交点。基因诊断的基本原理地贫的基因诊断DNA提取试剂盒提供的试剂有：变性液、洗涤液Ⅰ、洗涤液Ⅱ、溶解液、D溶液。简单步骤：1.低渗：100ul抗凝血+1000ul双蒸水5min2.变性：加变性液250ul5min3.洗涤：洗涤液Ⅰ300ul×3洗涤液Ⅱ500ul×2无水乙醇500ul×14.干燥：56℃烤箱20-30min5.溶解：加入溶解液100ul56℃10min经典做法：(25ul反应管为例)双蒸水8.5ul10*buffer2.5uldNTP2ul引物2ulDNA模板8ulTaq酶2ul(2U预变性后加)目前商品化的试剂使用热启动DNA聚合酶，只需加模板进行扩增即可。基因诊断的基本原理地贫的基因诊断PCR扩增α预变性96℃15min变性98℃45s复性64℃90s35cycles延伸72℃3min72℃5minβ预变性95℃10min变性94℃60s复性55℃30s35cycles延伸72℃30s72℃5min地贫的基因诊断电泳123456781DNAMARK2αα/αα3αα/-α4.24αα/-α3.75--SEA/-α4.26--SEA/-α3.77--SEA/αα8-α3.7/-α4.22027190415841375947831地贫的基因诊断ASO1.电泳检测：确认PCR扩增成功2.变性：6-8ml2×SSCPCR扩增产物沸水中加热变性10min膜条3.杂交：42℃杂交箱内杂交2小时以上4.洗膜：用0.5×SSC40ml42℃杂交箱内洗膜15min5.显色：POD液中室温轻摇浸泡30分钟，2×SSC冲两遍柠檬酸钠19mlTMB1ml避光5-20min后观察结果3%H2O210ul地贫的基因诊断ASO地贫的基因诊断ASO采集样本提取DNAPCR扩增杂交显色电泳检测α地贫报告β地贫报告!