rna提取 及rtpcr

RNA提取及常见失败原因研究基因的表达和调控时，需要从组织或细胞中分离纯化RNA。RNA质量的高低常常影响RT-PCR、cDNA库构建和NorthernBlot等分子生物学实验的成败。Trizol是一种新型总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。目的主要试剂均一和完整—两个关键指标完整：最大限度避免内外源RNase降解—高活性RNA酶抑制剂。（异硫氰酸胍和盐酸胍）均一：有效去除DNA和蛋白质。酚-氯仿抽提1.Trizol试剂含有苯酚，具有毒性和刺激性，注意操作。2.RNase污染的主要来源是操作过程中手和空气中的浮尘，注意配带手套，样品尽可能盖严；3.细胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全会降低最后得率，因为一部分RNA会残留在未裂解的细胞中。细胞裂解之后要看不见颗粒状物质（结缔组织和骨除外）。在清洗和裂解细胞时最好在低温下操作，防止在操作过程中释放的内源RNase降解了RNA。4.酵母和一些细菌由于细胞壁的特殊结构，可以加入Trizol试剂同时加入无RNase的玻璃珠并剧烈振荡，使细胞裂解充分。2-8℃避光保存一年。准备工作RNA酶（Rnase）是导致RNA降解最主要的物质。此酶非常稳定，在一些极端的条件下只可暂时失活，但限制因素去除后又迅速恢复活性。常规高温高压灭菌方法和蛋白抑制剂不能使所有的Rnase完全失活。1.它广泛存在于人的皮肤上，因此制备RNA时必须戴手套。2.RNase的又一污染源是取液器。根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用以DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，可基本达到要求。3.塑料制品、玻璃和金属物品的处理（1）塑料制品：尽量使用一次性无菌塑料制品。已标明RNase-free的塑料制品，如没有开封使用过，通常不必再处理。处理的步骤如下：在玻璃烧杯中注入去离子水，加入DEPC使其终浓度为0.05%~0.1%（DEPC-H2O）。（DEPC二乙基焦碳酸酯为活性很强的剧毒物，须在通风橱中小心使用）将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中，注入DEPC-H2O，使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中，在通风柜中37℃或室温下处理过夜。将DEPC-H2O小心倒入废液瓶中，将装有DEPC-H2O处理过的塑料制品的容器以铝箔封口，高温高压蒸汽灭菌至少30分钟。灭菌塑料制品烘烤干燥，置洁净处备用。（2）玻璃和金属物品250℃烘烤3小时以上。DEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。试验所用试剂也可用DEPC处理,加入DEPC至0.1%浓度,然后剧烈振荡10分钟,再煮沸15分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC,否则DEPC也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA活性。但DEPC能与胺和巯基反应,因而含Tris和DTT的试剂不能用DEPC处理。DEPC(二乙基焦碳酸酯)乳腺癌细胞系：(I)MDA-MB-231(II)MCF-7内参基因：ＧＡＰＤＨ（451bp）目的基因：Survivin（812bp）实验材料实验步骤（一）总RNA提取的细胞用胰酶消化，300g离心5min，吸尽上清PBS洗2次加入1mlTRIZOL，充分震荡混匀，室温放置5min加入0.2ml氯仿，充分震荡，室温放置5min12000rpm离心15min，将上层无色水相转移至一EP管加入0.5ml异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min4℃，12000rpm离心10min，弃上清。沉淀即为总RNA加入75%乙醇1ml，轻轻洗涤（必要时4℃，10000rpm离心5min）吸干乙醇，风干加入15μl无RNase的55～60℃的水，溶解RNA，吸光度法测定总RNA浓度（取5μl上述RNA加ddH2O至100μl）13.RNA检测(1)测定样品在260nm和280nm的吸光值按1OD=40μg/mlRNA计算RNA的产量。OD260/OD280在1.8-2.0。(2)进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳,确定RNA的完整性和污染情况。28S—18S—5S—低得率A．样品裂解或匀浆处理不彻底B．最后得到的RNA沉淀未完全溶解A260/A2801.65A．检测吸光度时，RNA样品不是溶于TE，而是溶于水。低离子浓度和低pH条件下，A280值会较高。B．样品匀浆时加的试剂量太少。C．匀浆后样品未在室温放置5分钟。D．水相中混有有机相。E．最后得到的RNA沉淀未完全溶解。RNA降解A．组织取出后没有马上处理或冷冻B．样品或提取的RNA沉淀保存于-5－-20℃，未在-60－-70℃保存。C．细胞在胰酶处理时被破坏。D．溶液或离心管未经RNase去除处理。实验原理RNA的多聚酶反应（RT-PCR）是以mRNA为模板进行逆转录反应（reversetranscription，RT）与PCR，可用于检测单个细胞或少数细胞中少于10个拷贝的RNA模板。RNA扩增包括两个步骤：•在单引物的介导下和逆转录酶的催化下，合成RNA的互补cDNA，加热后cDNA与RNA链解离，然后与另一引物退火，并由DNA聚合酶催化引物延伸生成双链靶DNA，最后扩增靶DNA.mRNAcDNAPCR产物两步法：由于单管反应时RT和PCR都不能在最佳条件下进行并且容易相互干扰，常只适宜用基因特异引物扩增较短的基因，及定量PCR。两步法则是将RT和PCR分别进行，这样使得两个反应充分发挥各自的特点，更为灵活而且严谨，适合那些GC含量、二级结构严重的模板或者是未知模板，以及多个基因的RT-PCR。•RT-PCR—一步法和两步法•一步法：利用同一缓冲液，在同一体系中加入逆转录酶、引物、Taq酶、4种dNTP直接进行mRNA反转录与PCR扩增。利用反转录酶和Taq酶作用在同一体系中直接以mRNA为模板进行反转录和其后PCR扩增，从而使mRNA的PCR步骤更为简化。所需样品量减少到最低限度，临床小样品的检测非常有利。用一步法扩增可检测出总RNA中小于1ng的低丰度mRNA。该法可用于低丰度mRNA的cDNA文库的构建及特异cDNA的克隆，并有可能与Taq酶的测序技术相组合，使得自动反转录、基因扩增与基因转录产物的测序在单管中进行。•RT-PCR—一步法和两步法反转录PCR(RT-PCR)mRNAcDNAPCROligodT,逆转录酶特异性引物,Taq酶用途:获得所需cDNA片段；检测基因表达注意问题：1、PCR效率差异，重复性2、内参选定3、共同扩增4、扩增片段位置5、mRNA丰度仪器旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，0.2mlPCR微量管，双面离心管架，PCR仪，台式离心机，琼脂糖凝胶电泳系统，水漂，恒温水浴。试剂RNA反转录酶，3U/μLTaqDNA聚合酶，PCR缓冲液（10×，MgCl2free），25mMMgCl2，dNTP，引物，模板质粒pMD18-T-NK，无菌ddwater。5’AAAAAAAA3’TTTTTTTTmRNAcDNAA）在0.2mL微量离心管中，加入如下各成分总RNA2μgOligo（dT）或randorm9mers2μLddH2O至28μLM-MLV5×ReactionBuffer8μldNTPs(10mmol/L)2μlRibonucleaseInhibitor(25u/μl)1μlM-MLVRTase(200u/μl)1μl（即总体积：40μl）70℃孵育5min，冰浴2分钟42℃孵育60min75℃孵育10min，破坏M-MLV活性，-20储存备用实验中应注意的问题RNA提取过程中防止降解去除DNA的污染实验中注意设置阴性对照在冰上操作