质粒DNA的提取和琼脂糖凝胶电泳

化工专业实验实验名称质粒DNA的提取与琼脂糖凝胶电泳班级化21姓名张腾学号2012011864成绩实验时间2014.12.26同组成员王乙汀、陈秉伦、梁有向1实验目的（1）掌握碱裂解法提取质粒的原理和方法（2）掌握琼脂糖凝胶电泳分离鉴定DNA的原理和方法。2实验原理2.1质粒质粒（plasmid）是在细菌中以独立于染色体之外的方式存在，是细菌染色体外的小型双链环状DNA复制子。理论上讲，所有的细菌株系都含有质粒，有些质粒携带有帮助其自身从一个细胞转入另一个细胞的信息，即F质粒，有些则表达对一种抗生素的抗性，即R质粒，还有一些携带的是参与或控制一些不同寻常的代谢途径的基因即降解质粒。质粒的大小不定，小的不到1kb，大的超过500kb，每个质粒都有一段DNA复制起始点的序列，它帮助质粒DNA在宿主细胞中复制。对细菌的某些代谢活动和耐药性表型具有一定的作用。目前，已发现有质粒的细菌有几百种，已知的绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA分子(简称cccDNA)。细菌质粒的相对分子质量一般较小，约为细菌染色体的0.5%～3%。根据相对分子质量的大小，大致上可以把质粒分成大小两类：较大一类的相对分子质量是40×106以上，较小一类的相对分子质量是10×106以下(少数质粒的相对分子质量介于两者之间)。每个细胞中的质粒数主要决定于质粒本身的复制特性。按照复制性质，可以把质粒分为两类：一类是严紧型质粒，当细胞染色体复制一次时，质粒也复制一次，每个细胞内只有1～2个质粒；另一类是松弛型质粒，当染色体复制停止后仍然能继续复制，每一个细胞内一般有20个左右质粒。一般分子量较大的质粒属严紧型。分子量较小的质粒属松弛型。质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属严紧型，而在变形杆菌内则属松弛型。在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。人工构建的质粒可以集多种有用的特征于一体，如含多种单一酶切位点、抗生素耐药性等。常用的人工质粒运载体有pBR322、pSC101。pBR322含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含有5种内切酶的单一切点。如果将DNA片段插入EcoRI切点，不会影响两个抗生素基因的表达。但是如果将DNA片段插入到HindIII、BamHI或SalI切点，就会使抗四环素基因失活。这时，含有DNA插入片段的pBR322将使宿主细菌抗氨苄青霉素，但对四环素敏感。没有DNA插入片段的pBR322会使宿主细菌既抗氨苄青霉素又抗四环素，而没有pBR322质粒的细菌将对氨苄青霉素和四环素都敏感。pSC101与pBR322相似，只是没有抗氨苄青霉素基因和PstI切点。质粒运载体的最大插入片段约为10kb(kb表示为千碱基对)。图1.质粒作为载体在基因工程中的应用应用质粒作为基因克隆的载体分子，携带外源基因进入细菌体内进行扩增或表达，一个重要前提条件是要获得批量纯化的质粒DNA分子。质粒的提取方法很多，大多包括3个主要步骤：细菌的培养、细菌的收集和裂解。在质粒DNA的分离和纯化过程中，毫无疑问，宿主细胞的裂解是分离质粒DNA实验操作的关键步骤。常用的质粒DNA分离方法有3种：碱裂解法、煮沸法和去污剂裂解法。前两种方法比较剧烈，它们可以破坏碱基配对，使宿主细胞的线性染色体DNA变性，而共价闭合环状DNA由于拓扑缠绕，两条链不会互相分离。当外界条件恢复正常时，质粒的DNA双链又迅速恢复原状，重新形成天然的超螺旋分子，其大小范围在1KB至200kb以上不等。所以，质粒DNA提取与纯化是最基本的分子生物学实验技术，其中，碱裂解法提取的质粒产量高、纯度好，是一种最为常用的方法。2.2碱裂解法碱裂解法提取质粒的实验原理是在pH12.0~12.6碱性环境中，细菌的线性大分子量染色体DNA变性分开，而共价闭环的质粒DNA虽然变性但仍处于拓扑缠绕状态。将pH调至中性并有高盐存在及低温的条件下，大部分染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心，可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，收集上清即可得到富集的质粒DNA。近年来，随着基因治疗和DNA疫苗的发展，质粒逐渐成为一种新型的生物大分子医药产品，药用质粒的大规模制备成为生物下游过程的重要研究课题。采用此碱裂解法制备高拷贝数质粒（如pUC系列）时，质粒DNA的产量通常约为3～5μg/ml菌液。随着生化技术的发展，市场上出现了商品化的试剂盒用于提取及纯化质粒，有些试剂盒采用了传统的SDS碱裂解法，结合DNA制备膜技术，具有高效、快速、方便之特点。还有些试剂盒利用层析的原理纯化质粒DNA，DNA分子中磷酸二酯链骨架在高盐作用下脱水，使得暴露的磷酸基团吸附硅胶，经水溶性缓冲液重新水化后，DNA能从层析柱上回收。大多数试剂盒分离纯化的原理为先使经过分离的质粒DNA吸附在柱或膜上，然后常规用乙醇洗涤，最后用水将吸附在柱上或膜上的DNA用水溶解下来。实验中采用的普通质粒提取试剂盒为Tiangen普通质粒小提试剂盒。下图为质粒DNA制备的原理。图质粒DNA制备原理2.3凝胶电泳电泳技术是分离、纯化DNA和鉴定DNA大小的重要方法。生物大分子如核酸、蛋白质、多糖等，在一定的pH条件下，可以解离成带电荷的离子。在电场中这些带电荷的离子，可以根据电荷的性质向正极或负极移动。这种带电荷物质在电场中向其相反电极泳动的现象称为电泳。在电泳过程中通常要考虑泳动率，泳动率又称迁移率，是指带电荷颗粒单位时间荷单位电场强度下，在电泳介质中泳动的距离。泳动率与样品分子荷电密度、电场中电压及电流成正比，与样品的分子大小、电泳介质黏度与电阻成反比。不同大小的带电分子具有不同的泳动率。不同的电泳介质具有对样品不同的分辨效果。在进行核酸电泳时，注意DNA分子的构象，在分子质量相同时，以高度超螺旋的DNA泳动速度最快，随着超螺旋程度降低，相应DNA泳动速度依次变慢，最慢者为线状双链DNA。在通常情况下，线状DNA分子在一定浓度琼脂糖介质中泳动的速度与其分子质量的对数成反比。因此，利用DNA分子长度（bp）的负对数与泳动距离作图，对于DNA片断分子质量测定方便而准确。缓冲液是电场中的导体，其种类、pH及离子强度会直接影响电泳效果。通常要选择缓冲离子泳动速度应和样品的泳动速度一致，否则会引起带型不均一或不对称峰的出现。在分离核酸时，常选用较高的pH值，使样品带负电荷，在电场中向正极泳动。以电泳支持介质主要可以分为聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶，以电泳方式可以分成垂直型和水平型。一般来说，聚丙烯酰胺凝胶电泳用来分离较短的核酸片断（5～500bp），分辨率高于琼脂糖凝胶电泳，而后者多用于0.1～60kb的较大核酸片断。垂直型电泳装置分离效果比水平型略好，多用于聚丙烯酰胺凝胶电泳。水平型电泳几乎为所有的琼脂糖电泳所采用，其优点是灌胶、制板及加样等操作都较为方便且不会因机械压力引起低浓度凝胶的破裂。图.水平电泳装置结构示意图琼脂糖凝胶电泳是分离、鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便、快速，分离范围较广，用各种浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至50kb的DNA。琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线型高聚物。琼脂糖凝胶的制备是将琼脂糖在所需缓冲液中熔化形成清澈、透明的溶液，然后将溶液倒人胶模中，令其凝固。凝固后，琼脂糖形成一种固体基质，其密度取决于琼脂糖的浓度。在外加电场作用下，带负电荷的DNA分子向阳极迁移，迁移速率由以下参数决定：①DNA的分子大小；②琼脂糖浓度；③DNA的构象；④所加电压；⑤电场方向；⑥碱基组成与温度；⑦嵌入染料的存在；⑧电泳缓冲液的组成。DNA在琼脂糖凝胶中的电泳行为受DNA的碱基组成或凝胶电泳温度的影响不明显，琼脂糖凝胶电泳一般在室温下进行。琼脂糖浓度和所加电压对迁移速率的影响比较值得注意。一个给定大小的线状DNA片段，其迁移速率在不同浓度的琼脂糖中各不相同，采用不同浓度的凝胶有可能分辨长度范围广泛的DNA分子。在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是，随着电场强度的增大，高分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长。因此，随着电压的增大，琼脂糖凝胶的有效分离范围缩小。图.电泳上样示意图样品经电泳后形成的条带必须经过染色后才能被显示出，以进行分析和检测。观察琼脂糖凝胶中DNA的最简便方法是利用荧光染料进行染色。荧光物质含有一个可以嵌入DNA碱基之间的平面基团，DNA与之结合后在紫外线照射下呈现荧光。实验室中最常用的荧光染料是溴化乙锭（EB）。其原理是在紫外线照射时，核酸的吸收波长为254nm的紫外线并将能量传递给溴化乙锭，同时嵌入在核酸碱基间的溴化乙锭吸收302nm和366nm波长的紫外线，来自两方面的能量最终激发出波长为590nm的红橙色的可见荧光。通常用水将EB配制成lmg/mL的贮存液，于室温下避光保存。该染料通常以0.5μg/mL的浓度掺人到凝胶和缓冲液里，电泳后直接观察。也可在不加EB的条件下进行凝胶电泳，电泳完成后将凝胶浸在含EB(0.5μg/mL)的电泳缓冲液或水中，于室温下染色20min左右后观察。EB的存在将使线状双链DNA的电泳迁移率降低近15％。应该注意的是，溴化乙锭是强诱变剂，并有中度毒性，取用这种染料的溶液时务必带上防护手套。如不慎与皮肤接触，应立即用清水彻底冲洗，含有溴化乙锭的溶液在使用后，不得随意丢弃。出于安全性的考虑，本实验对凝胶的染色未采用溴化乙锭，而是选择了更加安全低毒的GoldViewTM核酸染料。它是一种新型的核酸染料，采用琼脂糖电泳检测DNA时，GoldView与核酸结合后能产生很强的荧光信号，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同。经过荧光染料染色后的凝胶，在暗室条件下，经过紫外灯照射激发可以出现相应的可见荧光。实验者可通过肉眼或仪器进行观察，紫外线投（反）射仪原理如图。随着科技的发展，各种自动化很高的相关仪器，设备相继问世。这些先进仪器的使用使得测量结果更加接近真实值，凝胶扫描仪和图像分析系统就是具有代表性的仪器。凝胶扫描仪主要用来对样品单向电泳后的区带进行扫描，从而得出定量的结果。凝胶扫描仪的出现大大缩短了电泳结果的分析时间，更主要的是提高了电泳结果分析的准确性。扫描仪所得的图谱通过计算机进一步进行数据加工处理，提高了数据的分辨率、准确度和灵敏度，特别是在背景扣除、积分方法等数据处理上可以根据情况来选定，从而使得测量结果与真实情况更加接近。而图像分析系统将凝胶谱图摄制下来，进一步将信息数字化，同时输入到计算机中再进行分析，使测定结果更加迅速、精确。现在的凝胶成像以及图像分析系统不但可以做蛋白质定量，而且也可以做荧光和放射自显影测量，大大地推动了分子生物学的研究进展。凝胶扫描仪的原理和结构与分光光度计基本一致。其结构分为光源、单色器（或滤光片）、样品室、光电倍增管、结果显示等几部分。样品室是为专门放置凝胶板而设计的。根据设置的不同光源，扫描仪可有不同的功能，如为紫外光源，可以扫描未经染色的凝胶。而采用可见光源的扫描仪只能对于染色凝胶进行检测。根据扫描仪视光路的不同，有透射方式测定和反射方式测定两种，前者能扫描可以透光的凝胶，而后者因光束方向可以改变，则可以扫描不透明的电泳转移膜、层析板等。2.4大肠杆菌及质粒载体大肠杆菌（Escherichiacoli，E.coli）是革兰氏阴性短杆菌，大小0.5×1～3微米。周身鞭毛，能运动，无芽孢。能发酵多种糖类产酸、产气，是人和动物肠道中的正常栖居菌，婴儿出生后即随哺乳进入肠道，与人终身相伴，其代谢活动能抑制肠道内分解蛋白质的微生物生长，减少蛋白质分解产物对人体的危害，还能合成维生素B和K，以及有杀菌作用的大肠杆菌素。它的主要特点有以下几点：1、大肠杆菌是细菌，属于原核生物；具有由肽聚糖组成的细胞壁，只含有核糖体简单的细胞器，没有细胞核有拟核；细胞质中的质粒常用作基因工程中的运载体。2、大肠杆菌的代谢类型是异养兼性厌氧型。3、人体与大肠杆菌的关系：在不致病的情况下（正常状况下），可认为是互利共生（