HPLC方法开发基础知识

©2011WatersCorporation1液相色谱方法开发基础©2011WatersCorporation2开发液相色谱方法ƒ液相色谱方法即液相色谱实验所需的基本参数,包括以下各项内容:—流动相:种类及配比(等度或梯度)—固定相:色谱柱类型及内径,长短—流动相输送系统参数:流速—检测器参数:检测波长,灵敏度等—温度控制—进样量ƒ以上参数即构成一个具体的HPLC方法,亦称色谱条件©2011WatersCorporation3评价液相色谱方法的标准ƒ问题∶什么样的分离结果是好的?分离度?©2011WatersCorporation4什么是液相色谱的分离度？分离度的定义：)w(wvv122112+−=RR:分离程度的量度©2011WatersCorporation5影响分离度的因素k′,α,Nƒ分离度方程∶–k′是保留因子,表达了被分离组分与柱填料的作用强弱–α是分离因子,描述两个组分分离的好坏程度,是化学因素–N是理论塔板数,描述色谱峰的谱带展宽程度⎟⎟⎠⎞⎜⎜⎝⎛⎟⎠⎞⎜⎝⎛−⎟⎠⎞⎜⎝⎛+=411''NkkRαα©2011WatersCorporation6保留因子k′ƒ改变k'值的方法∶–调节流动相的极性、pH、离子强度等–梯度淋洗ƒ与峰高的关系ƒ与R的关系©2011WatersCorporation7分离因子αƒ定义∶–α=1时两组分分不开ƒ改变α的途径–改变固定相–改变流动相–改变温度–改变样品的本身性质120102''kkttttRR=−−=ααα1−∝R©2011WatersCorporation8色谱柱的柱效Nƒ理论塔板数计算公式：ƒWσ方法–Wtan16切线法–Wh5.54半峰高–W3σ93σ–W4σ164σ–W5σ255σ21⎟⎠⎞⎜⎝⎛=WVNσ©2011WatersCorporation9α，k'，N:如何控制分离度?©2011WatersCorporation10开发方法的其它考虑因素ƒ分离度是色谱分离中主要考虑的因素ƒ除分离度之外,在开发色谱方法时,以下几个因素也都要考虑:ƒ灵敏度ƒ载样量ƒ分析速度ƒ溶剂损耗ƒ成本ƒ容易使用ƒ色谱柱寿命ƒ效率©2011WatersCorporation11方法开发的一般步骤ƒ文献检索,同事,思考?ƒ逐步的重复过程ƒ下一步的实验设计基于上一次实验的结果ƒ系统筛查ƒ评估pH,有机溶剂和固定相ƒ选择以上三项最好的结合ƒ微调/优化(温度,梯度坡度)©2011WatersCorporation12参照文献方法时的注意事项ƒ采用与文献方法相同的色谱柱(品牌,固定相,内径,长度…),否则不能重现文献结果ƒ注意不同HPLC系统体积的差异,若系统体积不同,则不能重现文献的梯度方法ƒ注意尽量避免流动相对色谱柱的损害(pH,缓冲盐的种类和浓度…)ƒ注意文献方法发表的年代背景,不要机械照搬,而应立足创新,尽可能采用HPLC新技术©2011WatersCorporation13方法开发有价值的信息ƒ样品溶解度ƒ被分析物数目–准备分离多少感兴趣的峰?ƒ化学结构ƒ官能团;被分析物有何不同–可电离物质?pH将如何影响色谱?ƒ检测特性–需要或可能的检测器种类?ƒ浓度范围和定量需求ƒ样品基质影响©2011WatersCorporation14色谱柱化学-键合相-基础硅胶颗粒溶剂pH选择性工具选择性©2011WatersCorporation15不同配体:不同的选择性ƒ疏水性的变化–较长的烷基链会提供较强的保留ƒ硅羟基活性的变化–影响峰的不对称和影响第二种相互作用ƒ水解稳定性的变化–硅胶颗粒表面上键合相的数目越多,柱寿命越长ƒ配体密度的变化–影响样品的载荷率©2011WatersCorporation16柱化学溶剂pH选择性工具选择性©2011WatersCorporation17试剂工具ƒ甲醇–弱洗脱剂–H-键溶剂ƒ乙腈–非质子溶剂–强洗脱剂–低粘度©2011WatersCorporation18ƒA（弱洗脱溶剂）溶剂的洗脱能力应该尽量的小，这样才能够使最快洗脱的物质有一个很合理的保留（K1）ƒB（强洗脱溶剂）溶剂的洗脱能力应该非常的强，这样才能够使最晚出峰的物质有一个合理的保留（K20）ƒA和B应该能够非常好的混合ƒA和B应该尽量的没有粘滞性梯度洗脱时溶剂的选择©2011WatersCorporation19色谱柱化学溶剂pH选择性工具选择性©2011WatersCorporation20流动相pH的影响ƒ只对有可离子化官能团的被分析物有影响ƒ胺ƒ羧酸ƒ酚ƒ有些组分包含一个或是更多的可离子化官能团ƒpH值的变化可能引起很强的选择性变化©2011WatersCorporation21pH0510152025303540024681012RetentionFactor(k)AcidBaseNeutralNote:中性化合物的保留不受pH值的影响碱保留增加酸保留增加硅胶pH范围杂化颗粒pH范围Neueet.al.AmericanLaboratory1999(22)36-39.反相保留图:流动相pH值的影响杂化填料无机硅胶©2011WatersCorporation22反相色谱方法开发实例ƒ色谱条件∶–色谱柱：C18，4mm×30mm–流动相：乙腈/水，不同的溶剂强度，60/40、50/50、40/60，由强渐弱–流速：2ml/minƒ样品：–①对羟基苯甲酸甲酯(MethylParaben)–②对羟基苯甲酸丙酯(PropylParaben)–③对羟基苯甲酸丁酯(ButylParaben)©2011WatersCorporation23实例1:改变保留因子k'60/4050/5040/60①②③①②②③③①ƒ实例1谱图©2011WatersCorporation24ƒ通过改变流动相改变选择性–同样强度的不同溶剂ƒ改变色谱柱的影响会更大实例2:改变选择性(α)①②③62:38/42:58/72:28/2322，③，②，①OHCNCHOHMeOHOHTHF©2011WatersCorporation25离子抑制色谱ƒ离子型化合物在反相色谱柱上不保留ƒ改变流动相的pH值，抑制样品离子的电离ƒ适用于弱酸性化合物的分离–降低流动相的pH值，使样品降低离子化–使用硅胶基质C18填料ƒ使用条件应在填料基质的安全范围内–硅胶柱的pH在2-8（较保险值3-7）之间H++Ac-HAcƒ在稀溶液中:©2011WatersCorporation26离子抑制色谱实例ƒ在乙腈/水及pH=7时，多数保留时间很短，无法完全分离。CHOOHOCH3COONaCHOCOOHOCH31234©2011WatersCorporation27常用缓冲液及其pH值名称pKaPhosphoricAcid磷酸2.12(pKa1)FormicAcid甲酸3.75SuccinicAcid琥珀酸4.19(pKa1)AceticAcid乙酸4.75SuccinicAcid琥珀酸5.57(pKa2)PhosphoricAcid磷酸7.21(pKa2)BoricAcid硼酸9.24PhosphoricAcid磷酸12.32(pKa3)©2011WatersCorporation28离子对色谱法ƒ在反相色谱流动相内加入“离子对”试剂–与样品中可电离的组份形成“对离子”–目的:在反相色谱柱上分离离子型化合物ƒ离子对试剂的类型–PICA：磷酸季丁铵，适用于酸性组份–PICB：烷基磺酸盐，适用于碱性组份o烷基长度不同，形成对离子的能力不同o通常有：B5，B6，B7，B8–PICD4：磷酸二丁胺，适用于弱碱©2011WatersCorporation29离子对色谱机理OO(C~C)nSO3-Na+加(C~C)nSO3-N+C4C4C4C4N+C4C4C4C4OH-流动相加0.01M的SiOSiC18OOPIC-A试剂©2011WatersCorporation30离子对色谱分析水溶性维生素NCONH2NH3CHOCH2OHCH2OHNNNNH3CH3COOCH2CHCHCHHOHOHOCH2OHNNH3CNH2CH2NSCH2CH2OHCH3{}Cl-+1.Niacinamide烟酰胺2.Pyridoxine吡哆素，VB63.Riboflavin核黄素，VB24.Thiamine硫胺素，VB1©2011WatersCorporation31用不同的离子对试剂色谱柱∶μBondaPakC183.9mm×300mm溶剂∶1.MeOH/H2O,PIC-B72.MeOH/H2O,PIC-B53.MeOH/H2O,PIC-B7/B5②①③④1.如用PIC-B7，在②③分开的情况下，保留时间太长②①③④2.如用PIC-B5，峰①②④分不开②①③④3.如用PIC-B7加B5，各组份分开，且保留时间合适©2011WatersCorporation32离子对色谱-水溶性维生素保留时间与PIC试剂B之间的关系保留体积ml36ml4ml烟酰胺吡哆素(VB6)核黄素(VB2)硫胺(VB1)B5B750%(B5/B7)©2011WatersCorporation33离子对色谱的优缺点ƒ优点:–可用反相色谱分析离子–离子和中性化合物可在同一次色谱分析中完成–通过选择不同的PIC试剂可使选择性得到惊人的改善,特别是对中性和离子型溶质ƒ缺点:–PIC试剂的平衡较慢–推荐专用色谱柱作离子对分析–当心PIC试剂在甲醇,乙腈等溶剂中沉淀–当心用过的离子对试剂的化学污染©2011WatersCorporation34用离子对？还是离子抑制？中性物质PICA酸性物质PICB碱性物质RSO3HRCOHOROSOHOOROPOHOORNH2R2NHR3N(R4N+)-CH3OH/0.01M(NH4)2HPO4CH3CN/H2OCH3OH/H2O磺酸染料苯甲酸马来酸雌酮磷酸地塞米松氢化可的松对苯二甲酸二乙脂，苊多巴胺VB2，肾上腺素可待因洁尔灭离子抑制CH3OH/1%HAcCH3CN/NaH2PO4氢化可的松对苯二甲酸二乙酯，苊©2011WatersCorporation35关于梯度方法©2011WatersCorporation36什么是梯度方法90/10,CH3CN/H2O80/20,CH3CN/H2Oƒ梯度:流动相的组成或流速随洗脱时间的变化而变化©2011WatersCorporation37ƒ流动相的组成或流速随洗脱时间的变化而变化—起始为弱洗脱能力的溶剂，随着时间的推移逐步变为洗脱能力较强的溶剂—惯例oA通常是洗脱能力较弱的溶剂或者流动相oB通常是洗脱能力较强的溶剂或者流动相梯度的定义©2011WatersCorporation38ƒ样品在色谱柱上有宽范围的保留ƒ能够增加峰容量，更好的对复杂包含多种物质的组分进行强有力的分离ƒ使峰形变窄ƒ单位时间内的分离能力增加，有效的缩短分析时间为什么要进行梯度洗脱？©2011WatersCorporation39梯度洗脱的特点ƒ优点–单位时间的分离能力增加–检测灵敏度提高ƒ缺点–仪器设备要求高–不适合某些检测方式–色谱柱需再生–定量分析的重复性较低©2011WatersCorporation40梯度洗脱的方式ƒ高压梯度及低压梯度溶剂A溶剂B泵A泵B混合器A高压梯度溶剂A溶剂B比例阀（溶剂混合点）混合器B低压梯度（溶剂混合点）泵©2011WatersCorporation41ƒ优点—系统体积小—没有严格的在线脱气机要求ƒ缺点—一个泵只能控制一路溶剂—最多仅允许三路溶剂（通常二路）“高压混合”“高压”梯度系统二元梯度系统，在高压侧混合©2011WatersCorporation42“低压”混合“低压”梯度系统ƒ优点—只需一个泵头—同时使用多种溶剂（通常不超过四种）ƒ缺点—较大的系统体积—需要在线脱气©2011WatersCorporation43梯度滞后:系统体积的影响死体积/谱带展宽体积(无色谱柱时)滞后(系统)体积滞后(系统)体积溶剂输送系统(泵)检测器进样器色谱柱梯度混合器溶剂输送系统(泵)高压梯度注意∶滞后体积包括进样器、阻尼器、混合器及其管路比例阀