食品中有害有毒物质

第七章食品中有害有毒物质食品中的有毒有害物质：食品中内源性有害成分（过敏原、有害糖苷类、凝集素、皂素等）食品中外源性有害成分（重金属、农药残留、二噁英、兽药等）食物中的真菌毒素7.1农药7.1.1农药残留概述农药残留物是指由于喷施农药后存留在环境和农产品、食品、饲料、药材中的农药及其降解代谢产物、杂质，还包括环境背景中存有的污染或持久性农药的残留物再次在商品中行成的残留。农药残留物量是指农药本体物及其代谢物的残留量的总和，并构成不同程度的毒性。农药的残留毒性（残毒）：残留农药在食物上达到一定的浓度（即残留量）后，人或其它高等动物长期进食这些食物，就会使农药在体内积累起来，引起慢性中毒。农药的残毒的三个来源：施用农药后药剂对作物的直接污染；作物对污染环境中农药的吸收；生物富集与食物链。农药的残毒所造成的污染是多方面的。在农药残留的分析过程中，分离技术往往占主导地位。由于各种色谱检测器的选择性，针对不同类型的有机化合物常需要不同的前处理技术。7.1.2农药的分类•根据防治对象的不同，常将防治害虫的农药称为杀虫剂，防治红蜘蛛的称为杀螨剂，防治作物病菌的称为杀菌剂，防治杂草的称为除草剂，防治鼠类的称为杀鼠剂。•根据化学组成和结构可分为无机农药、有机农药（例如有机氯、有机磷、有机砷、有机氟等）。•主要介绍有机氯杀虫剂、有机磷杀虫剂、拟除虫菊酯杀虫剂的残留分析技术。7.1.3有机氯杀虫剂的残留分析有机氯农药（Organochlorinepesticides,OCPs)是具有杀虫活性的氯代烃的总称。OCPs分为三种类型：六六六；DDT及其类似物；环戊二烯衍生物。这三类不同的氯代烃均为神经毒性物质，正常环境下不易分解。易通过食物链在生物体脂肪中富集和积累。从20世纪70年代开始，许多工业化国家相继限用或禁用DDT、六六六及狄氏剂。有机氯杀虫剂的残留分析方法在农药残留中是研究最早的。在有机氯农药（OCPs）分析领域最为广泛使用的检测技术是气相色谱/电子捕获检测器（GC-ECD），它具有灵敏度高、分离效果好、定量准确等特点，是一种经典的分析方法。色谱柱通常是弱极性至中级性柱，检测器一般用ECD。DDT1874年Baeyer首次合成。Müller发现它的杀虫作用，获瑞士专利，并于1948年获诺贝尔医学奖。对温血动物急毒性低，对大白鼠的口服急性毒性LD50为250-500mg/kg，但DDT以及主要的代谢物DDE容易在动物脂肪中积累。HCCl3ClClClClClClClCl六六六（BHC）六六六的工业品是多种异构体的混合物，其活性组分γ-BHC仅占15%左右，其余均为无效组分。广谱性杀虫剂。γ-BHC积累体内的危险性很小，对大白鼠口服急性毒性LD50为76-200mg/kg，积累在动物脂肪、奶中的BHC能很快排出体外。但工业品中β-BHC积累的可能性和慢性中毒性很大。γ-BHCClClClClClCl艾氏剂艾氏剂具有较高的蒸气压，可以以颗粒剂的形式作为土壤杀虫剂。大鼠口服急性毒性LD50为67mg/kg，由于它在血液中有较高的溶解度，因此容易扩散到所有的组织中，特别是脂肪组织。有机氯杀虫剂残留的分析方法•有关有机氯杀虫剂的残留分析方法在农药残留中是研究最早的，对于仅有BHC和DDT农药的前处理可用浓硫酸磺化法处理，对同时含有艾氏剂、狄氏剂等多种有机氯杀虫剂时，一般采用氟罗里硅土柱净化。选用的色谱柱通常是弱极性至中极性柱。检测器一般用ECD和MSD。水果、蔬菜中多种有机氯残留农药的毛细管气相色谱测定方法：1.样品的提取与净化水果、蔬菜类样品置于组织捣碎机中高速捣碎，作为试验样品。称取样品20g于250ml具塞三角烧瓶中，加入100ml石油醚－丙酮（4：1），振荡30min。用布氏漏斗抽滤，以适量石油醚洗涤残渣，滤液合并于500ml分液漏斗中，用水洗涤除去丙酮。上层石油醚经无水硫酸钠脱水收集于三角瓶中，旋转蒸发浓缩至5ml。•在2cm（ID）×25cm玻璃层析柱中，于底部加入少许玻璃棉，依次加入1cm高的无水硫酸钠，5gFlorisil和1cm无水硫酸钠。先以40ml无水乙醚－石油醚液（15：85）预洗柱子，弃掉淋出液。把浓缩的样液移入柱内，以适量无水乙醚－石油醚液（15：85）洗脱，收集全部洗脱液，于40℃水浴上减压浓缩至40ml，以石油醚定容，供色谱分析。2.色谱条件色谱柱：50m×0.25mm（内径）；膜厚0.20um，固定相为CP-Sil19CB，弹性石英毛细管柱。氮气作为流动相，进样温度250℃，检测器温度300℃，采用不分流进样方式，进样量1uL，进样0.75min后吹扫。柱温程序：柱温100℃，恒温4min以后以8℃/min的速率程序升温至240℃，继续恒温20min至样品全部流出。近几年来有机氯农药残留分析结果：海鸟蛋，海豹，鱼粉，鱼油：毒杀芬地表水，橄榄油：硫丹淡水鱼：DDE饮用水：16种OCPs水果蔬菜：9~24种OCPs药材：7~18种OCPs7.1.4有机磷杀虫剂残留的分析有机磷农药（OPPs)是含有C-P键或C-O-P、C-S-P、C-N-P键的有机化合物。大部分不溶于水，而溶于有机溶剂。在中性和酸性条件下稳定，不易水解，在碱性条件下易水解失效。接触可造成中毒，它们的毒性依赖于其结构和功能团。例如，含P=O键（如敌百虫、对氧磷）的毒性通常比含P=S（如马拉硫磷）大。这些化合物主要是抑制生物体内胆碱酯酶的酶活性，导致乙酰胆碱这种传导介质代谢紊乱，产生迟发性神经毒性，引起运动失调、昏迷、呼吸中枢麻痹甚至死亡。有机磷杀虫剂由于药效高，易被水、酶及微生物所降解，很少残留毒性等，因此目前在杀虫剂的使用方面，它仍然起主要作用。目前正式商品化的有机磷农药有上百种，如敌敌畏、敌百虫、马拉硫磷等。敌敌畏（DDV）•O，O-二甲基-O-（2，2-二氯）乙烯基磷酸酯•无色液体，有芳香味，在水中约能溶1%，能与大部分有机溶剂相溶。•DDV是一种触杀和胃毒杀虫剂。对蝇、蚊、飞蛾等击倒速度很快。•对雄大鼠的口服急性毒性LD50为80mg/kg，在温血动物体内很快降解。敌百虫•O，O-二甲基-1-羟基-2，2，3-三氯乙基磷酸酯•敌百虫是一种触杀和胃毒杀虫剂。对双翅目昆虫很有效。•敌百虫本身对乙酰胆碱酯酶抑制力很弱，但它在生理pH条件下就能转变成强抑制剂DDV。乐果•O,O-二甲基-S-（N-甲基氨基甲酰甲基）二硫代磷酸酯•第一个对哺乳动物低毒的有机磷内吸杀虫剂。•乐果是一种触杀性和内吸性杀虫杀螨剂。•乐果在贮存中不很稳定，特别在温度高和存在碱及二硫代磷酸二甲酯时会分解，主要是发生烷基化反应。铁可加速其分解。检测方法•检测有机磷的分析方法有波谱法、色谱法、酶抑制法三大类。•波谱法是跟据有机磷农药中某些官能团或水解、还原产物与特殊的显色剂在一定的条件下，发生氧化、磺酸化、酯化、配合等化学反应，产生特定波长的颜色反应来进行定性和定量测定，检测限在μg级水平。色谱法(1)薄层色谱法是一种比较成熟的、广泛应用的微量快速检测方法，检出限达0.1~0.01μg。(2)GCAOAC在20世纪80年代就对大部分有机磷农药建立了气相色谱分析方法，我国食品理化检验国家标准方法也采用了气相色谱检测有机磷杀虫剂。随着气相色谱仪的普及，对可能存在有机磷农药残留的样品，如食品、果蔬、饲料、水产品、土壤、水体及血液、化妆品等都建立了气相色谱分析方法。(3)HPLC对气相色谱不能检测的高沸点或热不稳定、易裂解变质的有机磷农药可以采用HPLC法检测。AOAC中有近半数的有机磷农药都建立了HPLC法，研究报道也较多。当使用GC或HPLC发现违规的农药残留时，必须使用其它方法来确认。可以利用GC借助其在两根或多根极性不同的柱子上的保留时间来确认，也可以用GC/MS。•酶抑制法是利用有机磷杀虫剂的毒理性质建立的一种快速检测方法。•由于有机磷能抑制乙酰胆碱酯酶的活性，使该酶分解乙酰胆碱的速度减慢或停止，再利用一些特定的颜色反应来反映被抑制程度，从而达到检测目的。•操作简单、速度快，不需昂贵仪器，特别适合现场检测以及大批量样品的筛选。•灵敏度、重复性和回收率相对较差。•新方法：酶抑制-生物芯片分析法。茶叶中多种有机磷农药残留量测定方法：提取称取0.5g粉碎茶叶于试管中，加入2ml蒸馏水和无水硫酸钠，在混匀器上混匀，加入2ml乙酸乙酯，混匀，离心，取上清液。残渣用乙酸乙酯和正己烷（1：1）混合液再提取一次，合并两次提取液，过活性炭小柱，用乙酸乙酯：正己烷（1：1）混合液洗脱，将洗脱液低温浓缩至0.5ml，供气相色谱分析。外标法峰面积定量。色谱条件•色谱柱：HP-1石英毛细管柱，氮磷检测器，流动相：氮气、氢气和空气。•程序升温：60℃（保持0.5min），以10℃/min，至250℃（保持3min）。•进样口温度：250℃。•检测器温度：300℃。•不分流进样：进样量1uL。7.1.5拟除虫菊酯的残留分析•拟除虫菊酯（pyrethroids)是一类重要的杀虫剂，具有高效、广谱、低毒和生物降解等特性。•拟除虫菊酯在化学结构上具有共同的特点之一是分子结构中含有数个不对称碳原子，因而包含多个光学和立体异构体。它们具有不同的生物活性，即杀虫效果也不大相同。拟除虫菊酯的检测在植物样品中拟除虫菊酯的测定要点：提取一般采用匀浆提取法，对于色素较深的样品，可在匀浆时加入活性炭再进行。也有用索氏提取器用乙醚提取的报道。提取溶剂多用丙酮。净化通常采取液液分配加柱层析法，层析柱填料多用氟罗里硅土和硅胶。检测仪器一般用气相色谱带电子捕获检测器，但也有用HPLC/UV的报道。气相色谱测定一般采用非极性至弱极性柱。除虫菊酯农药热稳定性较高，使用毛细管色谱柱在高温区段（250-280℃）有利于分离，杂质干扰较少，用ECD检测灵敏度较高，可以满足食品中拟除虫菊酯农药残留量的测定。将有机氯和拟除虫菊酯农药同时测定，在一般情况下，有机氯如BHC、DDT出峰在前，而拟除虫菊酯出峰在后。水果、蔬菜中拟除虫菊酯残留量测定1.前处理•称取约20g试样，至于锥形瓶中，加入适量丙酮，振荡40min，过滤。用丙酮洗涤残渣，将滤液收集在100ml容量瓶中，并用丙酮定容。•吸取5ml提取液于具塞离心管中，加入20ml2％硫酸钠溶液，用正己烷萃取两次。合并萃取液，并通过无水硫酸钠柱脱水并以少量正己烷洗涤柱。流出液合并后浓缩至1ml。在微型层析柱的下端填入少量脱脂棉，依次装入0.5cm高的无水硫酸钠、1g硅胶和1cm高的无水硫酸钠。用5ml正己烷预淋洗层析柱，弃去流出液。将浓缩液倒入柱内，以二氯甲烷淋洗层析柱，收集洗脱液，浓缩至干，再以正己烷定容，供气相色谱测定。2.色谱条件色谱柱：HP-5MS石英毛细管柱氮气：1ml/min柱温：60℃（保持0.5min），以10℃/min，至280℃（保持20min）进样口温度：260℃检测器ECD温度：280℃进样方式：不分流7.1.6多种类农药残留量测定方法目前国际上通常是使用一个前处理方法，用不同的仪器系列测定，同时测定多达上百种的农药，特别是GC/MS方法的使用使得在色谱上难以分离的化合物用选择离子的方式进行分别测定，可在一次进样中测定200多种农药。例：茶叶中多杂环类农药残留测定用GC/ECD检测怀疑含有的有机氯农药残留，再以GC/MS-MS进行确认及定量分析。水果、蔬菜和牛奶中农药残留的气质联机分析1.提取取50g切碎的样品（或牛奶）于捣碎器中，加入100ml乙腈－乙醇（95：5）混合液，捣碎5min。加入15g氯化钠，继续捣碎5min。转移40ml上层有机相于200ml离心瓶中，加入15g无水硫酸钠充分振荡，高速离心5min。定量移取30m至浓缩管中，通N2在35℃下浓缩至5ml。在固相萃取柱中加2cm无水硫酸钠，用5ml甲苯淋洗。将75ml淋洗液储备管、Envi-Carb固相萃取柱、SAX固相萃取柱和PSA固相萃取柱从上至下，按顺序相连，用乙腈-甲苯（3：1）预淋。将浓缩液转到储备管中，通氮气将样品推入Envi-Carb柱中。每次用