普通生物学23

23重组DNA技术简介目的与要求了解基因工程的相关技术和基因工程的应用及其成果；掌握重组DNA的基本步骤；理解基因工程主要的工具酶和基因克隆的质粒载体23.1基因工程的相关技术1.DNA的【变性】与【复性】、杂交分子2.分子探针寻找特定基因（图23.1）对探针的要求：纯一单链3.Southern印迹与Northern印迹Southern:分析基因的结构Nothern:确定基因的表达利用RNA探针探查基因4.原位杂交•检测不同类型细胞组成的组织中特定mRNA在单个细胞中的表达情况•FISH（荧光原位杂交）5.聚合酶链（式）反应（PCR）快速扩增特定的基因或DNA序列过程：高温变性，低温退火，适温延伸PCR23.2基因工程主要的工具酶23.2.1限制性内切核酸酶•在特定的DNA位点切断DNA。•酶切位点就在其识别序列内，识别序列最常见的为4或6个核苷酸对所组成。•切割方式：黏性末端平齐末端23.2.2DNA连接酶•催化DNA中相邻的3-羟基和5-磷酸基末端之间形成磷酸二酯键并把两段DNA拼接起来。•切口P298•缺口P298DNA连接酶的活性限制酶与连接酶的作用23.2.3反转录酶•从mRNA反转录合成cDNA的23.3基因克隆的质粒载体载体是一种可以将外源DNA片段送入宿主细胞进行扩增或表达的运载工具。质粒：一些在细菌中独立存在于其染色体之外，能够自主复制的小型双链环状DNA分子。高质量质粒的要求（P299）•具有复制起始点•携带易于筛选的选择标记•多克隆位点•小分子量高拷贝数•安全性pBR32223.4重组DNA的基本步骤23.4.1获得目的基因1.限制性内切酶酶切产生待克隆的DNA片段•部分酶切，完全酶切，基因文库2.人工合成DNA3.反转录酶酶促合成法•cDNA文库4.聚合酶链（式）反应扩增特定的基因片段23.4.2DNA分子的体外重组•将外源基因插入载体黏性末端连接法平齐末端连接法23.4.3重组DNA分子引入宿主细胞和筛选鉴定1.重组DNA引入宿主细胞•热冲击•电转化2.重组克隆的筛选与鉴定•抗生素抗性基因的利用在细菌质粒中克隆基因的全过程23.5基因工程的应用及其成果简介1.生产新型疫苗、胰岛素和人的生长激素•低成本，安全2.动物基因工程与畜禽品种改良•转基因鱼、猪•生物反应器（表23-1）3.在遗传病的基因诊断和基因治疗中的作用•【基因治疗】•生殖系统基因治疗的安全问题•基因诊断23.6遗传工程的风险和伦理学问题病原微生物等的风险•安全措施和规则伦理学问题•自然力量的使用和自然和谐的打破•基因治疗的安全性（对后代的改变）基本概念和知识点变性、复性、杂交、Southern印迹、Northedrn印迹、聚合酶链式反应、载体、完全酶切、部分酶切作业限制酶酶切DNA有几种方式？平齐末端与黏性末端是怎样产生的？举例说明。补充材料限制性核酸内切酶（restrictionendonucleases），简称限制酶，是一类能识别和切割双链DNA分子中的某些特定核苷酸序列的核酸水解酶，主要从细菌中分离得到。根据结构和功能特性，把限制酶分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型。Ⅰ型限制酶的切点不固定，很难形成稳定的、特异性切割末端；Ⅲ型限制酶对DNA链的识别序列是非对称的，不产生特异性的DNA片段，故基因工程实验中基本不用Ⅰ型和Ⅲ型限制酶。血源性乙肝疫苗是用无症状的HBsAg携带者的血液制成。它的制备步骤大致为：采用高滴度HBsAg阳性携带者的血液，分离出血浆且除去其中有感染的HBV颗粒后，再将浓缩与纯化HBsAg进行充分灭活，以消灭其中可能存在的一切已知病毒以及消除HBsAg表面可能存在的全部宿主蛋白，然后添加佐剂及防腐剂而成。为确保疫苗的安全性，每一阶段均需取样做无菌试验、热源试验及动物安全试验等，以检查疫苗中是否存在其他病原体及血液中的抗原物