1ApoB的基础理论与临床应用价值

1.ApoB的基础理论与临床应用价值载脂蛋白B(apolipoproteinB)是LDL颗粒中惟一的蛋白质成分。在正常血浆中存在两种apoB，即apoBl00和apoB48。apoBl00主要由肝脏合成，在VLDL的组装和分泌中起重要作用，它在血浆中的浓度为6O～120mg／dl。apoB48主要在小肠中合成，对乳糜微粒(CM)的组装和分泌是不可缺少的。因此，对膳食中脂肪的吸收apoB48起着非常重要的作用。一、载脂蛋白B的性质apoB的昀主要物理化学特性是不溶解于水溶液，极易发生自身的聚合。在分离过程中apoB也容易被蛋白酶水解和氧化。在SDS-PAGE电泳中测定apoBl00的分子量为549kD，apoB48的分子量为264kD。apoB中也含有碳水化合物，糖的含量约占4％～10％。apoB分子中有19个潜在的N一连接的糖基化位置，还有7个不同区域可与肝素紧密结合。这些结合区域除能促使富含三酰甘油的脂蛋白与毛细血管的内皮细胞结合之外，它们还能促使脂蛋白脂肪酶水解脂蛋白(VLDL和CM)核心中的三酰甘油，使之VLDL形成IDL和LDL。apoBl00和apoB48均有高度的免疫原性，用它们免疫家兔可形成多克隆抗体，这两种抗体之间具有交叉反应，表明这两种apoB含有共同的抗原决定族。在apoB的分子结构中含有25个半胱氨酸，它们在分子中的分布很不均一，其中12个分布于前500个氨基酸残基中。这25个半胱氨酸中有16个是以二硫键的形式存在。apoB以两种形式存在，即apoBl00和apoB48。在人体内，apoB48产生于小肠，apoBl00产生于肝脏，小肠也可能产生一些apoBl00。apoB48是由B100的氨末端的一半所组成，含2152个氨基酸残基，不能与LDL受体的结合域结合。它是乳糜微粒和其残粒(remnant)的主要成分。apoBl00含4536个氨基酸残基，是VLDL和IDL和脂蛋白(a)[Lp(a)]的主要载脂蛋白，是LDL的惟一载脂蛋白。apoBl00有两个区域相似于apoE，被用于与LDL受体相结合，其中从第3359到3367位氨基酸残基序列具有高度的保守性，带有很强的正电荷。这一区域既能调节VLDL与LDL受体的相互作用，也能调节LDL受体的表达。用apoBl00单克隆抗体研究的结果证实，apoB基因位点的突变大约使人群中10％～20％个体胆固醇水平受到明显影响。但也有家族分析资料表明，apoB基因位点不是影响血浆apoB水平的主要位点，像家族性混合型高脂蛋白血症(FCH)或由于LDL引起的血脂异常都与apoB基因位点没有关联。但是，如果含有脂蛋白脂肪酶(LPL)、apoAI／apoCⅢ／apoA—IV基因簇和apoE基因位点的变异，那么它们对群体中大部分个体的apoB水平都具有一定的影响。apoBl00水平的升高是几种疾病的主要特征，如高apoB血症(hyper-apoB-emia)、FCH和致动脉粥样硬化脂蛋白表型。高apoB血症是早发性冠心病患者的一个共同的特征。在这些患者中apoB的水平相当于家族性高胆固醇血症(FH)患者血浆中的水平，但是LDL—c水平浓度则很低。对血脂正常的个体和对高脂蛋白血症病人的大量分析结果表明，在染色体中有一个特异的动脉粥样硬化敏感位点(atherosclerosissuspectibilitylocus，ATSL)控制着LDL颗粒的大小。该位点在第19号染色体的短臂，接近LDL受体位点和胰岛素受体基因位点。虽然具有胰岛素抗性的个体都具有致动脉粥样硬化的脂蛋白表型(ALP)，但是并不能完全肯定这个ALP表型是由胰岛素受体基因变异造成的，还是因为另一个更接近于LDL受体的基因即ATSL位点的存在。二、载脂蛋白B的物理化学结构、性质及功能(一)apoB的物理化学结构脱脂后的apoB在水容液中容易聚集，不易溶解，对研究其结构带来不少困难，它既不溶于4．2mol／L的四甲基尿素(tetramethylurea)，也不溶于水溶液的缓冲液。当用有机溶剂脱脂，它在SDS中是以二聚体的形式存在。在分离过程中apoB易于被蛋白酶水解、氧化1或者机械地切变(shearing)。Goto等曾用不同的化合物来修饰apoB并研究其结构，发现不同化合物对apoB的构象有不同程度的影响，其影响程度是：羧丙酰基重氮化酰基化或氨基化。化学修饰也可能改变apoB的抗原性，但不影响其光学性质，还原甲基化apoB中的赖氨酸和精氨酸可使其丧失与LDL受体结合的能力，说明apoB中赖氨酸和精氨酸与LDL受体的结合密切相关。apoB的分子量过去在不同实验室得到的结果差异很大，过去30年中研究者应用了不同的方法，包括X射线散射(scattering)、电子显微镜、溴化氰裂解、凝胶过滤、分析超速离心和SDS-凝胶电泳等，分子量从8kD～55kD。这些差异主要是由于蛋白酶的分解、氧化剂的作用、apoB分子的聚集等原因所致。Kane是第一个报道apoB存在亚类，并用SDS-PAGE测定了apoBl00和apoB48的分子量，它们分别为549kD和264kD。Yang等人以溴化氰完全裂解apoBl00的C一末端片段，然后用(反相)高效液相层析纯化，再以氨基酸分析仪定量测定其氨基酸，按这种方法，如果不计其中的碳水化合物，所得apoBl00的分子量为496．820+2．484kD，该结果与用cDNA推导出的人apoBl00的氨基酸序列的结果512．937kD十分接近。人血浆LDL含有80％的脂质和20％的蛋白质。apoB是其惟一的蛋白成分，它是一种糖蛋白，其中糖的含量占4％～10％，它们是半乳糖、甘露糖、N一乙酰胺基葡萄糖和唾液酸。也有人认为apoB的糖含量为8％～10％、甘露糖占4.8％、半乳糖为2.1％、唾液酸为1.7％、氨基已糖为0.9％，并分离了两种糖肽。这些碳水化合物与天门冬酰胺相连。在apoB分子中有19个潜在的N连接的糖基化位置。Weisgraber和Rall指出，在apoBl00分子中有7个不同位置可与肝素紧密结合。apoBl00有高度的免疫原性，将LDL注射给家兔可产生高滴度的抗体，用纯化的B100和B48免疫家兔所形成的多克隆抗体有交叉反应，说明两种apoB含有共同的抗原决定簇。Marcel等已用这些抗体制出在apoBl00、B48、B74和B86的特异抗原决定簇。这些结果说明B48序列包含在B100中。Young等采用一种特异性克隆抗体M19鉴定了23例人的抗体，发现B100中的一种共同的基因多态性，并显示它们有同一MBl9多态性存在于BI00和B48中。这些结果为B100和B48是同一基因的产物提供了有力的依据。(二)apoBl00cDNA和氨基酸序列1986年有数个实验室几乎同时克隆出人和大鼠的apoBl00的cDNA。一般鉴定cDNA克隆用两种方法：①用寡聚核苷酸探针与核酸杂交，该探针系从已知的apoB肽的氨基酸序列推导出核苷酸序列；②从不同表达的载体中部分克隆的cDNAs中以免疫方法鉴定类似apoB的特异产物。Chan等人采用λgtll为表达载体和多克隆及单克隆抗体，昀初克隆了相当于apoB的cDNA羧端部分的30个cDNA克隆。进一步对30个克隆核甘酸序列进行了测定，昀后拼接出apoBl00的全部序列，包括14070bp和polyA。全序列包括5’非翻译区78bp、13689bp编码区和3’一端的非翻译区303bp。1个多腺核苷化的信号(poly-adenylationsignal)肽，AATAAA区位于polyA尾巴上游的22bp处。apoBl00的mRNA是目前知道的真核生物(eukaryote)昀大的mRNA之一。apoBl00分子含有4563个氨基酸，其中27个氨基酸为信号肽，4563个为成熟的蛋白。其中2366个氨基酸残基已用直接分析apoBl00肽的方法加以证实。因此apoBl00是已知的昀大的单体蛋白质。它具有很高的疏水性，平均为O．913kcal／残基，比其他载脂蛋白为高。apoE、apoIV、apoAI、apoAⅡ、apoCI、apoCⅡ、apoCⅢ分别为O．718、O．772、O．806、O．863、O．825、O．838和O．752kcal／残基。此外发现在apoB分子中有少量但在统计学上有意义的内部重复的氨基酸区域。apoBl00的cDNA含有14121个核苷核，在5’和3’一端的非翻译区分别为128和304bp。apoBcDNA编码的27个疏水性氨基酸的信号肽在翻译时已断裂。Boerweinkle和Chan均证实在2apoB的信号肽存在3个氨基酸的插入或缺失的多态性，但后者不具备功能上的重要性。apoB肽链的特点之一是序列内部有高度的重复序列区，并与其他载脂蛋白序列有同源性，它们大都存在于可能形成双性螺旋的地方。(三)载脂蛋白B100在代谢中的作用概括起来apoBl00有以下四种主要功能：①合成、装配和分泌三酰甘油丰富的脂蛋白VLDL；②它可与脂质结合，是VLDL的结构蛋白；③与肝素及不同的糖蛋白结合，参与LDL与动脉粥样斑块的相互作用；④与LDL受体结合，调节LDL从血浆中的清除。1．apoBl00与脂质的亲和作用apoB100的整个肽链结构中含有许多疏水区。此外，在此区域还发现有9个双螺旋结构，每个双螺旋结构有22个氨基酸组成，它们的性质与其他载脂蛋白中结合脂质的双性螺旋性质相似。在apoBl00序列中能形成双性螺旋结构的序列大多集中在apoBl00分子的羧基端。ApoBl00还含有多个脯氨酸丰富序列，预计这些序列是用于形成β-片层和β-转角的。他们分布于除N-末端的1000个氨基酸之外的整个apoBl00序列上。虽然双性β-片层不存在于其他的载脂蛋白，该结构也与脂质有高度的结合潜力。因此在apoBlOO整个分子中有许多能与脂质的结合区，这一结果可以很好的解释apoB不会在脂蛋白分子之间进行相互转换的原因。其他载脂蛋白的序列中仅有1～2个脂质结合区，很容易在脂蛋白之间进行交换。如果apoBl00的整个序列都对脂蛋白结合十分重要，那么可以预料缩短的apoB100分子应该可以形成更致密的脂质贫乏的颗粒。Young和Grabam等均指出，缩短的apoB异构体结合比较少的脂，Young还发现，缩短的apoB所含氨基酸为2046(apoB48)存在于VLDL和LDL；另一缩短的apoB37含1728个氨基酸，存在于密度小于1．006g／ml部分中，但大部分存在于血浆HDL部分；另一缩短的apoB31含1425个氨基酸，仅存在于HDL的亚类和密度大于1.21g／ml部分中。上述实验结果表明apoB蛋白愈短，产生的分子颗粒愈重和脂质含量愈贫乏。发现apoB37，而非apoB31存在于VLDL部分，提示apoB的第1425至1728氨基酸序列之间可能具有形成富含三酰甘油的VLDL颗粒的关键区域。2．apoBl00氨基酸序列片段与功能的关系Yang等人对人apoBl00如何分布于LDL分子上做出了重要贡献。他们用胰酶测定LDL分子上哪些序列可以被胰酶水解，哪些不被水解。胰酶可以释放的称之为TR肽，不被胰酶释放的称之为TN肽。有些肽段既含有TR也含TN部分，则称之为MX肽。他们总共测定出apoBl00分子88％的氨基酸序列，按照可以被胰蛋白酶释放和不能释放的情况，他们将LDL分子上apoBl00的序列划分为5个区域：1区第1～1000个氨基酸段主要为TR肽；2区第1001～1700个氨基酸段含TR和TN肽，称之为MX区域；3区第1701～3070个氨基酸主要含TN肽，但也有TR肽；4区第3071～4100个氨基酸，主要为TR和MX肽；5区第4101～4536个氨基酸，几乎完全是TN肽。一般来说，疏水性愈强的区域，则愈不易被胰蛋白酶释放。控制胰蛋白酶释放和不释放apoB分子中的肽段的因素尚不完全清楚，不能简单地说能释放TR的肽是位于LDL分子的表面，而不能释放的片段则位于LDL中心。无论如何上述解释还是有一定道理的。特别是昀近Yang等纯化并测出13个apoBl00胰蛋白