国家食品药品监督管理局印发的“保健食品抗氧化功能评价方法”(新发布)

1附件1：抗氧化功能评价方法试验项目、试验原则及结果判定Items,PrinciplesandResultAssessment1试验项目1.1动物实验1.1.1体重1.1.2脂质氧化产物：丙二醛或血清8-表氢氧异前列腺素（8-Isoprostane）1.1.3蛋白质氧化产物：蛋白质羰基1.1.4抗氧化酶：超氧化物歧化酶或谷胱甘肽过氧化物酶1.1.5抗氧化物质：还原性谷胱甘肽1.2人体试食试验1.2.1脂质氧化产物：丙二醛或血清8-表氢氧异前列腺素（8-Isoprostane）1.2.2超氧化物歧化酶1.2.3谷胱甘肽过氧化物酶2试验原则2.1动物实验和人体试食试验所列的指标均为必测项目。2.2脂质氧化产物指标中丙二醛和血清8-表氢氧异前列腺素任选其一进行指标测定，动物实验抗氧化酶指标中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶任选其一进行指标测定。2.3氧化损伤模型动物和老龄动物任选其一进行生化指标测定。2.4在进行人体试食试验时，应对受试样品的食用安全性作进一步的观察。3结果判定3.1动物实验：脂质氧化产物、蛋白质氧化产物、抗氧化酶、抗氧化物质四项指标中三项阳性，可判定该受试样品抗氧化功能动物实验结果阳性。3.2人体试食试验：脂质氧化产物、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶三项指标中二项阳性，且对机体健康无影响，可判定该受试样品具有抗氧化功能的作用。2抗氧化功能检验方法MethodfortheAssessmentofAntioxidativeFunction1动物实验1.1实验动物选用10月龄以上老龄大鼠或8月龄以上老龄小鼠，也可用氧化损伤模型鼠。单一性别，小鼠每组10－15只，大鼠8－12只。1.2剂量分组及受试样品给予时间实验设三个剂量组和一个溶剂对照组，以人体推荐量的10倍（小鼠）或5倍（大鼠）为其中的一个剂量组，另设两个剂量组，高剂量一般不超过30倍，必要时设阳性对照组、空白对照组。受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天。1.3实验方法1.3.1老龄动物选用10月龄以上大鼠或8月龄以上小鼠，按血中MDA水平分组，随机分为1个溶剂对照组和3个受试样品剂量组。3个剂量组给予不同浓度受试样品，对照组给予同体积溶剂，实验结束时处死动物测脂质氧化产物含量、蛋白质羰基含量、还原性谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。1.3.2D－半乳糖氧化损伤模型1.3.2.1原理D-半乳糖供给过量，超常产生活性氧，打破了受控于遗传模式的活性氧产生与消除的平衡状态，引起过氧化效应。1.3.2.2造模方法选25-30g健康成年小鼠，除空白对照组外，其余动物用D-半乳糖40mg－1.2g/kgBW颈背部皮下注射或腹腔注射造模，注射量为0.1mL/10g，每日1次，连续造模6周，取血测MDA，按MDA水平分组。随机分为1个模型对照组和3个受试样品剂量组，3个剂量组经口给予不同浓度受试样品，模型对照组给予同体积溶剂，在给受试样品的同时，模型对照组和各剂量组继续给予相同剂量D-半乳糖颈背部皮下或腹腔注射，实验结束处死动物测脂质氧化产物含量、蛋白质羰基含量、还原性谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。1.3.3乙醇氧化损伤模型1.3.3.1原理3乙醇大量摄入，激活氧分子产生自由基，导致组织细胞过氧化效应及体内还原性谷胱甘肽的耗竭。1.3.3.2造模方法选25－30g健康成年小鼠（180－220g大鼠），随机分为4个组，1个模型对照组和3个受试样品剂量组，必要时可增设1个空白对照组。3个剂量组给予不同浓度受试样品，模型对照组给予同体积溶剂，连续灌胃30天，末次灌胃后，模型组对照组和3个剂量组禁食16小时（过夜），然后1次性灌胃给予50%乙醇12ml/kgBW，6小时后取材（空白对照组不作处理，不禁食取材），测血清或肝组织脂质氧化产物含量、蛋白质羰基含量、还原性谷胱甘肽含量、抗氧化酶活力。1.3.4脂质氧化产物测定1.3.4.1血中过氧化脂质降解产物丙二醛（MDA）含量测定血中过氧化脂质降解产物丙二醛（MDA）含量可采用荧光法和比色法测定，方法任选其一。1.3.4.1.1荧光法1.3.4.1.1.1荧光法原理MDA（malondiadehycle）是细胞膜脂质过氧化的终产物之一，测其含量可间接估计脂质过氧化的程度。1个丙二醛（MDA）分子与2个硫代巴比妥酸（TBA）分子在酸性条件下共热，形成粉红色复合物。以波长536nm为激发光，在550nm有最强荧光强度。可用荧光法进行微量测定。1.3.4.1.1.2仪器与试剂仪器：荧光分光光度计、微量加样器、恒温水浴锅、普通离心机、混旋器、具塞离心管试剂：10mmol/L四乙氧基丙烷（贮备液，棕色瓶4℃保存12个月），临用前用纯水稀释成1nmol/mL29mmol/L硫代巴比妥酸工作液硫代巴比妥酸0.209gEDTA.2H2025mg谷胱甘肽（还原型）1mg用0.02mol/LNaOH50mL溶解（微温助溶，棕色瓶4℃保存2周）酸水解液0.1mol/LH2SO4125mL0.1mol/LNa2SO4125mL加水150mL用H2SO4调pH1.5，加水稀释至500mL正丁醇以上所用玻璃器皿均需经50％硝酸浸泡24h后，再经蒸馏水、双蒸水淋洗干燥，试剂4（选AR级）最好用双蒸水配制。1.3.4.1.1.3实验步骤1.3.4.1.1.3.1样品制备全血上清液：取血50μl加入0.5mL生理盐水，2000r/min离心10min，取上清液待测。血清样品：取血0.5mL室温静置10min，2000r/min离心10min，取上清液待测。1.3.4.1.1.3.2标准曲线制作将10nmol/mL四乙氧基丙烷，用双蒸水稀释成0.0、0.25、0.5、1.0、1.5、2、3、5、10nmol/mL分别取0.1mL加入酸水解液2mL、TBA工作液0.5mL→混匀，避光、沸水浴60min→流水冷却至室温→3mL正丁醇振荡抽提1min→3000r/min离心5min→取上清液（正丁醇层）测荧光强度（入射狭缝1.5nm，出射狭缝5nm，激发波长536nm，发射波长550nm）以四乙氧基丙烷浓度为横坐标，荧光强度为纵坐标作图。1.3.4.1.1.3.3样品测定试剂空白管样本管标准管10mL具塞离心管0.1mL蒸馏水0.1mL血清*0.1mL标准＃酸水解液2mL2mL2mLTBA工作液0.5mL0.5mL0.5mL混匀，避光沸水浴60min，流水冷却正丁醇3mL3mL3mL振荡抽提1min，3000r/min离心5min*全血上清液0.5mL（空白管加蒸馏水0.5mL，标准管加标准0.1mL、蒸馏水0.4mL）＃1nmol/mL四乙氧基丙烷（标准）血清0.1mL（或全血上清液0.5mL）→加入酸水解液2mL、TBA工作液0.5mL→混匀，避光、沸水浴60min→流水冷却至室温→3mL正丁醇振荡抽提1min→3000r/min离心5min→取上清液（正丁醇层）测荧光强度（入射狭缝1.5nm，出射狭缝5nm，激发波长536nm，发射波长550nm）1.3.4.1.1.3.4计算公式：B-AB-A过氧化脂质含量（nmol/mL血清）＝———×C×K=————×1×1F-AF-AB-AB-A1过氧化脂质含量（nmol/mL血液）＝———×C×K=———×1×————F-AF-A0.05A：空白管荧光度B：样品荧光度F：四乙氧基丙烷荧光度C：四乙氧基丙烷浓度（1nmol/mL）K：稀释倍数51.3.4.1.2比色法1.3.4.1.2.1比色法原理MDA（malondiadehycle）是细胞膜脂质过氧化的终产物之一，测其含量可间接估计脂质过氧化的程度。1个丙二醛（MDA）分子与2个硫代巴比妥酸（TBA）分子在酸性条件下共热，形成粉红色复合物。该物质在波长532nm有极大吸收峰。可用分光光法进行测定。1.3.4.1.2.2仪器与试剂仪器：可见光分光光度计、酶标仪、微量加样器、恒温水浴锅、普通离心机、混旋器、具塞离心管。试剂：0.2M乙酸盐缓冲液pH3.50.2M乙酸溶液185mL0.2M乙酸钠溶液15mL1mmol/L四乙氧基丙烷（贮备液，4℃保存3个月），临用前用水稀释成40nmol/mL8.1%十二烷基硫酸钠SDS0.8%硫代巴比妥酸TBA0.2M磷酸盐缓冲液pH7.40.2M磷酸氢二钠1920mL0.2M磷酸二氢钾480mL1.3.4.1.2.3实验步骤1.3.4.1.2.3.1样品制备溶血液样品：取血20μL加入0.98mL蒸馏水制成2％溶血液。1.3.4.1.2.3.2样品测定试剂空白管样品管标准管2％溶血液*0.2mL40nmol/mL四乙氧基丙烷0.2mL8.1%SDS0.2mL0.2mL0.2mL0.2M乙酸盐缓冲液1.5mL1.5mL1.5mL0.8%TBA1.5mL1.5mL1.5mLH2O0.8mL0.6mL0.6mL混匀，避光沸水浴60min，流水冷却，于532nm比色注：如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行。*若用血清，样品管0.15mL，标准管0.15mL。1.3.4.1.2.3.3计算B–AB–A过氧化脂质含量（nmol/mL2%溶血液）＝————×C×K=—————×40×1F–AF–AB–AB–A过氧化脂质含量（nmol/mL血清）＝————×C×K=—————×40×1F–AF–A6A:空白管吸光度B：样品吸光度F：四乙氧基丙烷吸光度C：四乙氧基丙烷浓度（40nmol/mL）K：稀释倍数1.3.4.2组织中过氧化脂质降解产物丙二醛（MDA）含量测定1.3.4.2.1原理见1.3.4.1.2.11.3.4.2.2仪器与试剂仪器：可见光分光光度计、酶标仪、微量加样器、恒温水浴锅、普通离心机、混旋器、具塞离心管、组织匀浆器试剂：见1.3.4.1.2.21.3.4.2.3实验步骤1.3.4.2.3.1样品制备组织匀浆样品：取一定量的所需脏器，生理盐水冲洗、拭干、称重、剪碎，置匀浆器中，加入0.2M磷酸盐缓冲液，以20000r/min匀浆10s，间歇30s，反复进行3次，制成10％组织匀浆（W/V），3000r/min离心5－10min，取上清液待测。1.3.4.2.3.2样品测定试剂空白管样品管标准管10％组织匀浆0.2mL40nmol/mL四乙氧基丙烷0.2mL8.1%SDS0.2mL0.2mL0.2mL0.2M乙酸盐缓冲液1.5mL1.5mL1.5mL0.8%TBA1.5mL1.5mL1.5mLH2O0.8mL0.7mL0.7mL混匀，避光沸水浴60min，流水冷却，于532nm比色注：如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行1.3.4.2.3.3计算B-AB-A1过氧化脂质含量＝————×C×K=———×40×————————（nmol/mg组织）F-AF-A0.2×10%×1000A:空白管吸光度B：样品管吸光度F：四乙氧基丙烷吸光度C：四乙氧基丙烷浓度（40nmol/mL）K：稀释倍数1.3.4.3血清中8-表氢氧-异前列腺素（8-Isoprostane）测定1.3.4.3.1原理78-表氢氧-异前列腺素（8-Isoprostane）是体内脂质氧化应激反应稳定而具有特异性的标志物，其含量能间接反应因机体内自由基的产生而导致组织细胞的脂质过氧化程度。1.3.4.3.2仪器与试剂仪器：酶标仪、生化培养箱、微量振荡器、微量加样器、洗板机试剂：8-IsoprostaneKIAKit(酶联免疫试剂盒)8-IsoprostaneEIA抗体血清、8-IsoprostaneAChE示踪物、8-IsoprostaneEIA标准品、EIA缓冲液、洗涤缓冲液、吐温20、鼠抗-兔IgG抗体、EIA示踪染色剂、EIA抗体血清染色剂、Ellman’s试剂1.3.4.3.3实验步骤1.3.4.3.3.1样品制备小鼠眼内眦静脉丛取血，3000r/min离心10min。取上清液，用EIA缓冲液稀释15倍备用。1.3.4.3.3.2样品测定按试剂盒说明操作。8-表氢氧异前列腺素标准孔浓度分别为：500pg/mL、200pg/mL、80pg/mL、32pg/mL、12