RNA浓度测定(紫外光吸收法)

RNA浓度测定（紫外光吸收法）一、实验目的1.了解紫外吸收法测定RNA浓度的原理。2.熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用方法。二、实验原理核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统(－C＝C一C＝C一)，能够强烈吸收250~280nm波长的紫外光。核酸(DNA，RNA)的最大紫外吸收值在260nm处。遵照Lambert-Beer定律，可以从紫外光吸收值的变化来测定RNA物质的含量。在不同pH溶液中嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同，紫外吸收光也随之表现出明显的差异，它们的摩尔消光系数也随之不同。所以，在测定核酸物质时均应在固定的pH溶液中进行。三、实验器材1.UV-9100型紫外可见分光光度计。2.容量瓶100ml（*1）3.试管1.5cm*15cm（*9）4.吸管四、实验试剂1.酵母RNA2.标准RNA试剂（100微克每毫升）3.NaOH溶液五、实验步骤1.RNA粗品的制备称取8g干酵母粉于100ml烧杯中，加入0.2%NaOH溶液40ml，沸水浴加热30min，经常搅拌。冷却，然后4000r|min离心15分钟。取上清液，加入95%酸性乙醇40ml，边加边搅。加毕，静置5-10min离心。滤液先用95%乙醇洗2次，继而用无水乙醇洗2次，洗涤时可用细玻璃棒小心搅动沉淀。乙醇滤干后，滤渣即为粗RNA。2.样品的处理：称取0.2~0.25g粗品RNA，加2ml0.2%NaOH和1mlH2O溶解，调成糊状，再加入40~50mlH2O,溶解，调PH至7.0，后定容至100ml（再取2ml定容至100ml待测，此过程重复三次）3.标准曲线的绘制取六支试管，编号，按表加入试剂六、作表作图λ:260nmRNAm:0.2133g试管123456ABC标准RNA(ML)012345蒸馏水（ml）1098765RNA浓度μg|ml01020304050吸光度0.0000.2320.4330.6270.8170.9810.5190.5230.522测得样品RNA浓度为25.3μg|ml样品RNA质量为25.3μg|ml×50×100ml=0.1265g样品RNA纯度：0.1265÷0.2133=59.3%七、误差分析1.根据理论在5~45μg|ml与吸光值成正比，而该范围的两个端点没有取到，六号试管RNA浓度已经超出了范围，不能作为曲线的参考值。2.因为是做了三次平行试验，所以在样品三次定容时可能有些许误差。3.在配置标准RNA浓度时可能导致RNA浓度有些许的误差。4.样品中可能含有少量蛋白质，DNA，对紫外光也有强吸收作用会产生误差。八、思考题1．采用紫外光吸收法测定样品的核酸含量，有何优点及缺点？用紫外光吸收法测定样品的核酸含量，具有简单、快速、灵敏度高的优点，并且待测核酸样品中含有的微量蛋白质和核苷酸等吸收紫外光物质，产生较小测定误差。但该法在测定样品内混杂有大量的上述吸收紫外光物质时，则会产生较大测定误差，需要设法事先除去。2．若样品中含有核苷酸类杂质，应如何校正？00.20.40.60.811.20102030405060吸光度RNA样品线性(吸光度)当样品中含有核苷酸类杂质时，需要加钼酸铵-过氯酸沉淀剂处理，沉淀除去大分子核酸，测定上清液260nm处光密度，以此作为对照；再从未加沉淀剂测得的样品液260nm光密度中扣除。