食品卫生微生物检验的基本程序

第四章食品卫生微生物检验的基本程序•学习目标1了解取样前的准备工作，掌握样品的取样计划和取样方法2掌握样品的保存与制备要求3掌握实验设计、数据处理及结果报告等一.食品微生物检验的一般步骤样品采集样品处理样品保存选择参考菌群检验前的准备菌落总数大肠菌群致病菌分离培养分离培养增菌纯化染色镜检生化试验血清学试验动物试验结果报告第一节食品卫生微生物检验的取样方法•样品的采集应遵循所采样品具有代表性的原则。•必须采用正确的采样方法，并在样品的保存和运输过程中保持样品的原有状态•采样要遵循无菌操作原则，严防样品污染采样的要求1、严格遵守样品采集的操作规程。2、所采样品必须具有代表性。3、采样操作要防止污染，防止变质、损坏、丢失。4、不得加入防腐剂、固定剂等。5、样品采集和现场测定必须有二人以上参加。一、取样准备工作•对取样工具和一些试剂材料应提前准备和灭菌•1开启容器的工具•2样品移取工具•3取样容器•4温度计•5消毒剂•6标记工具•7样品运输工具•8搅拌器和混合器•9稀释液•10防护用品二、取样计划•1食品卫生微生物学检验的取样点•原料、生产线样品（半成品，环境）、成品、库存样品、零售商店或批发市场、进口或出口样品取样方案有：①ICMSF取样方案；②美国FDA的取样方案；③世界粮农组织（FAO）取样方案；④我国的食品取样方案。2常用食品卫生微生物学取样计划•样品的采样和取、制样是食品微生物检验的重要组成部分。•要得到准确的检测结果，必需正确掌握采样技术、样品传递、样品保存方法和样品的制备技术，保证样品在从采样到制样整个过程中的一致性。如果样品的采取、运送、保存或制备过程中操作不当，或者样品不具有代表性，就会使实验室的微生物检验结果毫无意义。•对采样人员和制样人员提出了很高的专业要求，既要保证样品的代表性和一致性，又要保证整个微生物检验过程在无菌操作的条件下完成。一、采样采样是指在一定质量或数量的产品中，取一个或多个代表性样品，用于微生物检验的过程。样品必须对采样的整个产品或批量具有代表性。样品的大小应能满足在需要时进行重复分析的需要。一）采样准备工作1.采样工具采样工具要达到无菌的要求。对采样工具和一些试剂材料应提前准备、灭菌。1）开启容器的工具：剪刀、刀子、开罐器、钳子等。双层纸包裹灭菌（121℃，15min），干燥洁净的环境中保存2个月。2）样品采集工具：灭菌的铲子、勺子、取样器、镊子、锯子、刀子、剪子、压舌板、木（电）钻、打孔器、金属试管和试子等。3）取样容器：灭菌的广口瓶或细口瓶，聚乙烯袋（瓶）、金属试管或类似的密封金属容器。最好不使用玻璃容器，运输中易碎。4）温度计：-20℃~100℃，温度间隔1℃。最好使用金属或电子温度计。使用前在70%~75%乙醇溶液或次氯酸钠（浓度不小于100mg/L）中浸泡消毒（不小于30s）。5)消毒剂：70%~75%乙醇溶液、中等浓度（100mg/L）次氯酸钠溶液等。6）标记工具：标签纸（不干胶标签纸）、油性或不可擦拭记号笔。7）样品运输工具：便携式冰箱或保温箱。8）天平：最大量程为2000g，感量为0.1g。9）搅拌器和混合器：必要时配备带有灭菌灌的搅拌器或混合器。10）稀释液：灭菌的磷酸盐缓冲液、0.1%蛋白胨水、生理盐水以及其他稀释液如脑心浸液肉汤、M肉汤、LB肉汤等。11）防护用品：对样品的防护。即保护生产环境、原料和成品等不会在取样过程中被污染，同样也保护样品不被污染。工作服、工作帽、口罩、雨鞋、手套等。事先消毒灭菌（或使用一次性无菌物品)。应根据不同的样品特征和采样环境，对采样物品和试剂进行事先准备和灭菌等工作。实验室的工作人员进入车间采样时，必须更换工作服，避免将实验室的菌体带入加工环境，造成加工过程的污染。2.采样方案微生物检验的特点是一个以小份样品的检测结果来说明一大批食品卫生质量，因此，用于分析的样品的代表性至关重要，也即样品的数量、大小和性质对结果判定产生重大影响。要保证样品的代表性首先要有一套科学的采样方案，其次使用正确的采样技术，并在样品的保存和运输过程中保持样品的原有状态。一般说来，进出口贸易合同对食品采样量有明确规定的，按合同规定采样；进出口贸易合同没有具体采样规定的，可根据检验的目的，产品及被抽样品批的性质和分析方法的性质确定采样方案。目前的采样方案多为ICMSF推荐的采样方案和随机采样方案。无论采取何种方法采样，每批货物的采样数量不得少于5件。对于需要检验沙门氏菌的食品，采样数量应适当增加，最低不少于8件。1)采样的术语批量货物：数量确定的货物，品质必须均匀一致。抽检货物：从批量货中的一个位置取出的少量货物。混合货样：条件允许，从某一特定批量采样、混合，即为混合货样，亦即大样。样品单位：从监督总体中抽取用于检验的样品中的单位产品。样品量：样品中所包含的样品单位数。合格判定数：在计数采样检查中，对接收批的样品允许出现的缺陷数或不合格品数的上限值，合格判定数又称可接受数。批：一批产品中或特定阶段或时间内代表相同质量样品的单元数。随机采样：在一批产品中，每个样品或单元都有同样被选择的机会。这种采样方法被称为随机采样。采样时常需要查阅随机数字表。代表性样品：广义上讲是指能够代表一个批的样品，而不是仅代表其中的一部分。要获得代表性样品需要以下四个条件：确定整批产品的采样点；建立能够代表整个产品特征的采样方法；选择样品大小；规定采样的频率。2）采样原则(1)根据检验目的、食品特点、批量、检验方法、微生物的危害程度等确定采样方案;(2)应采用随机原则进行采样，确保所采集的样品具有代表性;(3)采样过程遵循无菌操作程序，防止一切可能的外来污染；(4)样品在保存和运输的过程中，应采取必要的措施防止样品中原有微生物的数量变化，保持样品的原有状态。3）采样方案的类型依据GB4789.1-2010《食品安全国家标准食品微生物学检验总则》(1)类型采样方案分为二级和三级采样方案。二级采样方案设有n、c和m值，三级采样方案设有n、c、m和M值。n：同一批次产品应采集的样品件数；c：最大可允许超出m值的样品数；m：微生物指标可接受水平的限量值；M：微生物指标的最高安全限量值。注1：按照二级采样方案设定的指标，在n个样品中，允许有≤c个样品其相应微生物指标检验值大于m值。注2：按照三级采样方案设定的指标，在n个样品中，允许全部样品中相应微生物指标检验值小于或等于m值；允许有≤c个样品其相应微生物指标检验值在m值和M值之间；不允许有样品相应微生物指标检验值大于M值。例如：n=5，c=2，m=100CFU/g，M=1000CFU/g。含义是从一批产品中采集5个样品，若5个样品的检验结果均小于或等于m值（≤100CFU/g），则这种情况是允许的；若≤2个样品的结果（X）位于m值和M值之间（100CFU/gX≤1000CFU/g），则这种情况也是允许的；若有3个及以上样品的检验结果位于m值和M值之间，则这种情况是不允许的；若有任一样品的检验结果大于M值（1000CFU/g），则这种情况也是不允许的。（2）各类食品的采样方案按相应产品标准中的规定执行。（3）食源性疾病及食品安全事件中食品样品的采集由工业化批量生产加工的食品污染导致的食源性疾病或食品安全事件，食品样品的采集和判定原则按以上的（1）和（2）执行。同时，确保采集现场剩余食品样品。由餐饮单位或家庭烹调加工的食品导致的食源性疾病或食品安全事件，食品样品的采集按GB14938中卫生学检验的要求，以满足食源性疾病或食品安全事件病因判定和病原确证的要求。4）ICMSF采样方案简介国际食品微生物标准委员会（ICMSF）所建议的采样计划是目前世界各国在食品微生物工作中常用的采样方案。ICMSF提出的采样基本原则根据：a)各种微生物本身对人的危害程度各有不同。b）食品经不同条件处理后，其危害度变化情况：①降低危害度；②危害度未变；③增加危害度，来设定采样方案并规定其不同采样数。ICMSF的采样方法有些实验室在每批产品中，仅采一个检样进行检验，该批产品是否合格，全凭这个检样来决定。ICMSF方法与此不同，它是从统计学原理来考虑，对一批产品，检查多少检样，才能够有代表性，才能客观地反映出该产品的质量而设定的。ICMSF方法中包括二级法及三级法两种。二级法只设有n、с及m值，三级法则有n、c、m及M值。M即附加条件后判定合格的菌数限量。（1）二级采样方案自然界中材料的分布曲线一般是正态分布，以其一点作为食品微生物的限量值，只设合格判定标准m值，超过m值的，则为不合格品。检查在检样是否有超过m值的，来判定该批是否合格。例如生食海产品鱼的副溶血性弧菌标准为n=5，c=0，m=102，n=5即采样5个，c=0即意味着在该批检样中，未见到有菌落数超过m值的检样，此批货物为合格品。（2）三级采样方案设有微生物标准m及M值两个限量如同二级法，超过m值的检样，即算为不合格品。其中以m值到M值的范围内的检样数，作为c值，如果在此范围内，即为附加条件合格，超过M值者，则为不合格。例如：冷冻生虾的细菌总数标准n=5，c=3，m=101，M=102，其意义是从一批产品中，取5个检样，经检样结果允许≤3个检样的菌落数是在m和M值之间。如果有3个以上检样的菌落数是在m和M值之间或一个检样菌落数超过M值者，则判定该批产品为不合格品。（3）ICMSF对食品中微生物的危害度分类与采样方案说明为了强调采样与检样之间的关系，ICMSF已经阐述了把严格的采样方案与食品危害程度相联系的概念（ICMSF，1986）。在中等或严重危害的情况下使用二级采样方案，对健康危害低的则建议使用三级采样方案。ICMSF是将微生物的危害度、食品的特性及处理条件三者综合在一起进行食品中微生物危害度分类的。这个设想是很科学的，符合实际情况的，对生产厂及消费者来说都是比较合理的。下面结合表1加以说明。表1、ICMSF按微生物的危害度及食品处理进行情况分类级别危害程度对象微生物食品经不同处理后的危害度减少（加热）无变化（冷冻品立刻进食）增加危害度（未加热吃到吃前还有一段时间）三级方案1.食品的保藏2.轻度间接指标菌3.中度程度局部传播菌落总数大肠菌群、大肠杆菌金黄色葡萄球菌（指标菌）金黄色葡萄球菌蜡样芽孢杆菌产气荚膜梭菌例1n=5c=3例4n=5c=3例7n=5c=2例2n=5c=2例5n=5c=2例8n=5c=1例3n=5c=1例6n=5c=1例9n=10c=1二级方案4.中度程度广泛传播5.严重程度沙门氏菌副溶血性弧菌致病性大肠杆菌肉毒梭菌、霍乱弧菌伤寒沙门氏菌副伤寒沙门氏菌例10n=5c=0例13n=15c=0例11n=10c=0例14n=30c=0例12n=20c=0例15n=60c=0注：1.表中“减少”系指食品经加热杀死污染的细菌。2.“无变化”系指微生物数不增减例如冷冻食品或干燥食品。3.“增加”系指将食品保存在不良环境中使微生物易于繁殖和产毒。4.n：一批产品采样个数。c：该批产品的样品菌落数中，超过限量的检样数。根据表1中15种情况的举例，1-3可用三级法，4-5可用二级法来判定是否合格。考虑到以上15种情况，分别设定不同的取样数及检样污染数，在1-9例中检样需采5个（n=5），而污染检样数设定为c=3，2，1。在10-15例用二级法则不得检出该致病菌c=0。例如冷冻食品，细菌数按例2，大肠菌按例5，金黄色葡萄球菌按例8，沙门氏菌按例11的二级法判定。对食品处理应酌情考虑，例如生肉火腿中的金黄色葡萄球菌，被腐败菌所抑制，不易发生食物中毒，适用例7和例8。烹调加工后的熟肉，对腐败菌没有抵抗力，则易发生食物中毒，适用例9。加热盐腌的火腿，水分活性为0.86以下，金黄色葡萄球菌有增殖的可能性，因此适用例9。沙门氏菌水活性在0、94以下不能繁殖，适用例11，如上所述，应根据各种食品的危害度进行设定。ICMSF方法是以二级法、三级法和抽样的概念为基础，再将微生物的知识加进来，则可以提出各种食品的微生物标准。如表2。为了安全，冷冻生虾加热吃，减少危害度适用例1、4、10。冷冻加工虾，为