石蜡切片制备基本步骤

石蜡切片制备基本步骤一、准备工作（一）（一）洗涤实验所需器皿：（玻璃器皿的清洗）1、用洗衣粉将玻璃器皿表里擦洗干净反复洗刷2、将器皿在自来水下冲洗干净3、将器皿倒扣在铺有吸水纸或纱布的桌子上控干注：一般情况下，经以上步骤后，用蒸馏水洗过1~3次即可烘干备用，如果做特殊染色还需浸泡在酸性清洁液内12~24小时，再经自来水彻底冲洗，再用蒸馏水过洗1~3次烘干备用。（二）配制：硫酸洗液的配制清洁液（洗液）的配制：成分强酸液次强酸液弱酸液浓硫酸（ml）1000200100重铬酸钾（mg）63120100蒸馏水（ml）2002001000重铬酸钾1200g蒸馏水2000ml将2000ml浓硫酸缓缓倒入上述溶液中，边倒边用木棒轻轻搅拌（三）载玻片与盖玻片的处理1.将所需载玻片与盖玻片清洗后，放入硫酸重铬酸钾溶液中浸泡24小时2.流水冲洗，再用蒸馏水冲洗3遍3.95%~100%酒精浸泡24小时，用绸布擦干备用注：在将载玻片与盖玻片放入清洁液中时，要一片片地投入，使其不致重叠。二、准备工作（二）常用液体的配制（一）缓冲溶液：1．磷酸盐缓冲液A液：0.1mol/L磷酸二氢钠B液：0.1mol/L磷酸氢二钠A液与B液按比例混合调整到所需的PH值（3：7≈PH7.0）2．枸椽酸缓冲溶液A液：0.1mol/L枸椽酸B液：0.1mol/L枸椽酸钠A液与B液按比例混合调整到所需的PH值（6.2：42.8≈PH6.2）（二）固定剂：1．甲醛：10%甲醛福尔马林100ml蒸馏水900ml注：实际甲醛含量只有3.6~4.0%但习惯上都将其视为10%。2．10％中性福尔马林钙固定液甲醛液10ml蒸馏水90ml加碳酸钙至过饱和(以容器底部碳酸钙沉淀1~2cm厚为适度)充分振荡混合后，放置24小时取上清液使用。3．4%多聚甲醛：8%多聚甲醛多聚甲醛8g蒸馏水100ml加温至60℃左右，不时搅拌，成为乳白色溶液。滴加1NNaOH，并不停搅动至液体清明。1NNaOHlN等于1L溶液中某种物质1mol除以该物质的氢当量价所得数值的量氧化钠(NaOH)；分子量＝40．005，当量价＝11NNa0H的配制方法为：m＝40．005／1＝40．005g。取40．005gNaOH溶解于1L蒸馏水中4%多聚甲醛8%多聚甲醛50ml0.1M磷酸盐缓冲液50mlPH7.2先取50ml8%多聚甲醛，用0.1M磷酸二氢钠和0.1M磷酸氢二钠将PH值调至7.24．Bouin液：苦味酸饱和水溶液75ml36％~40％福尔马林液25ml冰醋酸5m15．改良Bouin氏固定液苦味酸饱和水溶液45ml95%酒精45ml36％~40％福尔马林液5ml冰醋酸5m16．Carnoy液：冰醋酸10m1氯仿30m1无水乙醇60m1以上三者临用前混合，预冷至4℃后使用。24小时后固定液失效。（三）染色液1．Harris苏木精液A液：苏木精1g无水酒精10mlB液：铵矾或钾矾20g蒸馏水200ml氧化汞0.5ml冰醋酸8ml将矾溶于水，加热溶解（B液），稍冷后将苏木精酒精液（A液）混入B液，加热，稍冷却，加氧化汞，再继续加热1分钟，染液变为紫色，注意在加氧化汞时宜逐渐少量加入，防止染液溅出。全冷后呈深紫色，将烧杯口用纱布盖好，隔夜过滤，在过滤液内每96ml中加4ml冰醋酸，放置1周后成熟，即可用于染色，保存期1~2个月。此染液在加醋酸后，对核染色特具选择性，故很适于脱落细胞的核染色。由于染液内已加有氧化剂，故不能长期储存，但利于配后即用。2．Mayer苏木精掖苏木精1g钾矾或铵矾50g碘酸钠0.2g蒸馏水1000ml水合氯醛50g枸橼酸1g将苏木精，钾矾及碘酸钠依次加入水内，略加热并搅拌，此时液体呈蓝色，待全溶后过夜。再加入水合氯醛及枸橼酸并加热至煮沸5分钟，冷后过滤备用。如不急用可不煮沸而在室温待其成熟，染液可较长期贮存使用。核染色鲜明，染色时间5—10分钟。用该染液染色后，不需分化，充分水洗蓝化后即可，伊红复染细胞质，使用一段时间后就要换新溶液。3．Hasnsen甲矾苏木精的配制A液：苏木精1g无水乙醇10mlB液：钾矾20g蒸馏水200mlC液：高锰酸钾1g蒸馏水16ml三液分别溶化后，将A液倒入B液，再加入C液3ml，充分搅拌均匀后加热至沸腾，1分钟左右，将容器置于冷水中使其迅速冷却，此液配后即可使用，染后无需碱化，细胞核即为蓝色，效果较好，高锰酸钾可以迅速氧化苏木精（每1g苏木精需0.177g高锰酸钾氧化）。4．伊红0.5~1%水溶液或酒精溶液。1．水溶性伊红伊红5~10g蒸馏水1000ml冰醋酸10滴先将水溶性伊红加入蒸馏水中，用玻璃棒搅起泡沫后过滤，再加冰醋酸。2．醇溶性伊红伊红5~10g70%~90%酒精1000ml冰醋酸10滴（四）其它1．麻醉剂：2~4%戊巴比妥钠，1ml/kg体重（45mg/kg）。2．各级浓度酒精的配制75%；85%；95%；100%酒精。75%和85%酒精用95%酒精配制；（取75ml95%酒精，加水至95ml，即为75%酒精）3．盐酸洒精多用于多种染色过程中的分色，如苏木精染色后分色。配法是在100ml的70％酒精内加0.5~1ml的浓盐酸(Hcl)。用盐酸酒精分色后要经自来水充分冲洗组织切片，去除所含的酸再作其他处理。4．碘酒取碘5g，溶于95％酒精80ml，再加入20ml蒸溜水即成5．生理盐水以氯化纳0.85~0.90g溶于100m1蒸馏水配成的生理盐水适用哺乳动物石蜡切片制备基本步骤之二三、取材，固定（一）实验动物的抓取及固定1．小白鼠、大白鼠的抓取及固定方法要点：（1）动作要轻缓；（2）不要突然袭击；（3）如发现动物的毛发竖起来时，最好停一会后再抓；（4）将四肢打开，固定在木板或方形蜡板上。2．实验家兔的抓取及固定方法要点：（1）随时抚摩其头部；（2）防止被其脚爪抓伤；（3）根据实验要求选择固定方法。3．豚鼠的抓取及固定方法要点：先用一只手扣住豚鼠背部，然后抓紧两耳间头颈部的皮肤，用另一只手托起臀部送到动物固定台上。（二）实验动物的编号、标记、分组和被毛去除方法1．编号和标记方法（1）染色法标记溶液：3%~5%苦味酸黄色2%硝酸银咖啡色（涂后光照10分钟）0.5%中性红或品红红色龙胆紫紫色编号原则：先左后右，从前到后左前脚为1，左侧腹为2，左后腿为3，头顶为4，腰背部为5，尾基为6，右前脚为7，右侧腹为8，右后腿为9。超过10可用不同的染色的标记液，一种染色为个位，另一种为十位数。（2）挂牌法（3）耳孔法一般来说，小型动物适宜用耳孔法和染色法，中型动物适用于挂牌法。2．实验动物的随机分组方法动物实验时，常常需要将选择好的实验动物，按研究需要分成若干个组，分组时为了避免人为因素的影响，常应用随机数字表进行完全随机化的分组。3．实验动物被毛去除方法剪毛法拔毛法剃毛法脱毛法：系用化学脱毛剂将实验动物被毛脱去，适用于无菌手术野的准备以及观察动物皮肤血液循环和病理变化。方法：将需脱毛部位的被毛先用弯头剪刀剪去，尽量剪短，勿剪破皮肤。然后用温水将该部位润湿，再用纱布包扎棉球的小棒蘸脱毛剂，在需脱毛部位涂一层，经2~3min后，用温水洗去该部位脱下的毛，自然晾干备用，切勿用纱布去擦，以免损伤皮肤。脱毛剂配方：（1）硫化钠3g肥皂粉1g淀粉7g加水适量调成糊状（2）硫化钠8g溶于100ml水中（3）硫化钠8g淀粉7g糖4g甘油5g硼砂1g加水75ml（三）实验动物处死处死动物的方法很多，无论是采用哪种方法，都要尽力避免使动物长时间陷于痛苦和濒于死亡状态。热爱生命，珍爱动物。1．空气栓塞致死法要点：（1）常用于大的动物（如：兔、猫、狗和猴等）；（2）用50~100ml注射器一只；（3）此方法迅速、方便，但各脏器淤血明显。2．麻醉后处死法注：采用此方法，取材后一定要确定动物是否已死亡，最好再行断颈。（1）吸入麻醉法要点：（1）适用于较小的动物（小白鼠、大白鼠、豚鼠和兔等）；（2）用乙醚浸泡过的脱脂棉；（3）时间大约1~2分钟；（4）注意防火（2）注射麻醉法要点：（1）适用范围较广；（2）注射方式可采用静脉、腹腔、皮下和肌内注射，最常用的是腹腔注射；（3）注射致死量一般视动物大小而定。3．脑、脊破坏法要点：（1）常用于蛙类；（2）用金属针经枕骨大孔进入，破坏大脑和脊髓。4．断头处死法要点：（1）常用于小动物；（2）用剪刀剪断颈椎；（3）如果没有特殊要求，最好不要使头和躯干分离。5．断椎法要点：（1）常用于大白鼠和小白鼠；（2）一手固定头部，一手拽住实验动物的尾部，轻轻一拉扯断其颈椎，使其脱位，椎管内急性损伤瘫痪或死亡后取材；（3）此方法处死动物组织结构保存较好。（四）实验动物解剖解剖步骤1．实验动物被麻醉或处死后，将其；固定在动物解剖台上，用纱布蘸取生理盐水湿润被毛；2．从下颌至耻骨联合沿正中线切开皮肤；3．打开腹腔：沿肋骨下缘腹正中，用镊子提起腹壁切开腹壁肌肉，至耻骨联合，从肋骨下端向脊柱方向，将两侧腹壁剪开，充分暴露腹腔内脏器；4．打开胸腔：用剪刀沿肋骨的肋软骨和骨的连接处由下向上剪开，不要剪断锁骨，剪时应尽量贴着胸内壁，并注意不要剪断胸骨两侧的大血管。然后将肋弓提起，暴露腹腔内脏器。（五）取材取材一定要迅速，应在动物处死后立即进行解剖和切取组织材料，否则会引起细胞发生死后变化（如组织自溶及腐败现象等），进而失去原有的结构，如果进行酶组化染色，将会使大量的酶失活和丢失。取材方法和注意事项（1）取材用的刀剪必须锋利，取材时应用镊子夹该组织的周围的结缔组织，凡是用镊子夹过的或用手压过的组织均不可用。（2）根据实验要求选择不同的取材方法（整体取出脏器法、单个脏器取出法和切取组织块法等）（3）取材的先后顺序原则。根据死后组织结构改变的速度的快慢而定。先腹腔后胸腔，先消化管后肝、脾等多血的器官及神经组织。（4）取材组织块的大小既要保证组织的完整性，又要力求小而薄，一般以1.0cm×1.0cm×0.5cm为好，但有些特殊要求的可视情况而定。（5）较小的组织或器官（淋巴结、松果体、脑垂体和神经节等）应整体固定，但要破坏其表面一侧的被膜。（6）管状及囊状组织（消化管的取材）都不应斜切，先将一段肠管或食管剪下，从中剪开管腔，使之成片状，然后将其铺在纸板下，黏膜面朝上，用大头针或细线将四边固定，用生理盐水漂洗黏膜表面，然后固定。（7）较细的管状脏器（输尿管、输精管、输卵管、中动脉和静脉等）应取下1~2cm长，平铺于硬纸片上或吸水纸上分段固定。（8）取材要尽量注意脏器的完整性。（9）应根据所要观察的部位及实验目的进行选择组织的切面。对于病理材料，除切取病变部位外，还要切取病变和正常组织交界部分的区域，以利于进行正常组织与病理组织的对比观察分析。（10）取材时要注明取材时间、组织器官名称、固定液名称、组织块的数量、所取组织位于器官的部位等，以备查。（六）固定1．固定的目的（1）防止组织溶解及腐败，以保持组织和细胞与正常生活时的形态相似；（2）使细胞内蛋白质、脂肪、糖、酶等各种成分转变为不溶性物质，以保持它原有的结构与生活时的相仿；（3）组织细胞内的不同物质经固定后可以产生不同的折光率，对染料也产生不同的亲和力，造成光学上的差异，使得在生活情况下原来看不清楚的结构变得清晰起来，并使得细胞各部分容易着色，有利于区别不同的组织成分。（4）固定剂的硬化作用，增加组织硬度，便于制片。2．固定的对象和方法（1）固定的主要对象是蛋白质；（2）固定液的量要足够，其固定液的量一般不少于组织总体积的10倍以上（一般为1：20）。对于某些需要制作神经染色和酶组织化学染色的组织固定，比一般的固定要严格。（3）特殊的固定方法（注射或灌注固定）：某些组织块由于体积过大或固定液极难渗入内部或需要对整个脏器或整个动物进行固定，宜采用此方法，将固定液注入血管，经血管分支到整个组织和全身，从而得到充分固定。①局部灌注固定：肺：肺内含有空气，固定难以渗入，可将固定液从气管、支气管或肺动脉注入固定液，从支气管注入时速度一定要慢，量不宜过多。注射固定后可将整个肺投入固定液中6~12小时，再分别切成小块。肝、肾：经肝动脉或肾动脉注