多重荧光PCR毛细管电泳进行微卫星不稳定性分析中的常见问题

多重荧光PCR-毛细管电泳进行微卫星不稳定性分析中的常见问题作者：潘菲，宋坤，盛弘强，来茂德作者单位：潘菲(浙江大学医学院,病理学与病理生理学系,杭州,310058;杭州师范大学,基础医学部,杭州,310036)，宋坤,盛弘强,来茂德(浙江大学医学院,病理学与病理生理学系,杭州,310058)刊名：临床与实验病理学杂志英文刊名：CHINESEJOURNALOFCLINICALANDEXPERIMENTALPATHOLOGY年，卷(期)：2008，24(5)被引用次数：1次参考文献(16条)1.TautzDHypervariabilityofsimplesequencesasageneralsourceforpolymorphicDNAmarkers1989(16)2.BolandCR.ThibodeauSN.HamiltonSRANationalCancerInstituteWorkshoponMicrosatelliteInstabilityforcancerdetectionandfamilialpredisposition:developmentofinternationalcriteriaforthedeterminationofmicrosatelliteinstabilityincolorectalcancer1998(22)3.SchramlE.LionTInterferenceofdye-associatedfluorescencesignalswithquantitativeanalysisofchimerismbycapillaryelectrophoresis2003(01)4.BergKD.GlaserCL.ThompsonREDetectionofmicrosatelliteinstabilitybyfluorescencemultiplexpolymerasechainreaction2000(01)5.况少青.王建民.黄薇应用多重PCR进行微卫星荧光标记-半自动基因组扫描[期刊论文]-中华医学遗传学杂志1998(02)6.LeeSC.BergKD.ShermanMEMicrosatelliteInstabilityIsInfrequentinMedullaryBreastCancer2001(06)7.QuagliaNC.NormannoG.DambrosioAMultiplex-touchdownPCRassayforthedetectionandgenotypingofHelicobacterpylorifromartificiallycontaminatedsheepmilk2005(10)8.OnofriV.AlessandriniF.TurchiCDevelopmentofmultiplexPCRsforevolutionaryandforensicapplicationsof37humanYchromosomeSNPs2006(01)9.杨柏林.谷云飞.赖仁胜散发性结直肠癌微卫星不稳定性及其与临床病理生物学的关系[期刊论文]-世界华人消化杂志2007(10)10.BurtonMP.SchneiderBG.BrownRComparisonofhistologicstainsforuseinPCRanalysisofmicrodissected,paraffin-embeddedtissues1998(01)11.VliU.BrandstrmM.JohanssonMInsertion-deletionpolymorphisms(indels)asgeneticmarkersinnaturalpopulations200812.WangM.MurphyKM.KuleszaPMoleculardiagnosisofmetastasizingoligodendroglioma:acasereport2004(01)13.MurphyKM.BergKD.GeigerTCapillaryElectrophoresisArtifactDuetoEosinImplicationsfortheInterpretationofMolecularDiagnosticAssays2005(01)14.刘莉.吴谨.侯一平6FAM-HEX-TMR-ROX四色荧光分析体系的构建[期刊论文]-中国法医学杂志2006(05)15.CanzianF.SalovaaraR.HemminkiASemiautomatedassessmentoflossofheterozygosityandreplicationerrorintumors1996(14)16.ZhouCZ.PengZH.ZhangFLossofheterozygosityonlongarmofchromosome22insporadiccolorectalcarcinoma[期刊论文]-WorldJournalofGastroenterology2002(04)相似文献(2条)1.期刊论文胡守友.房良华.谢玲.唐翔.赖仁胜.HUShou-you.FANGLiang-hua.XIELing.TANGXiang.LAIRen-sheng液体样品中肿瘤细胞基因的检测-临床肿瘤学杂志2009,14(12)目的:建立检测患者体液中肿瘤细胞基因异常的检测技术.方法:应用基因测序法、多重荧光PCR法分别检测22例肺癌患者胸腹水脱落细胞EGFR基因突变及25例尿样本尿液脱落细胞微卫星不稳定性(MSI).结果:22例肺癌患者的胸腹水脱落细胞中有1例检测出EGFR第19外显子突变.11例泌尿系肿瘤患者尿液样本中10例有不同程度的MSI,1例为正常,4例膀胱癌术后、5例炎性和异型增生患者、5例正常体检者尿液样本中均未发现MSI.结论:基因测序法和多重荧光PCR法可作为肿瘤患者诊断、筛查及指导临床治疗的肿瘤细胞基因检测技术.2.学位论文潘菲应用荧光标记多重PCR对散发性结直肠癌进行微卫星不稳定性检测2008结直肠癌是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤之一。结直肠癌(Colorectalcarcinoma，CRC)从发生机制上可分为两种不同的类型：染色体不稳定和微卫星不稳定(microsatelliteinstability，MSI)。MSI肿瘤的发生原因是DNA错配修复(mismatchrepair，MMR)功能障碍，在复制重复DNA序列时常出现错配修复失败。显然在DNA错配修复缺陷的结直肠肿瘤中，微卫星改变是一个重要的分子表型特征。MSI最初在家族性非息肉性结直肠癌(HNPCC)肿瘤中得到确定，其原因是错配修复基因的突变。典型的HNPCC患者90％以上为MSI瘤。也有15％左右的散发性结直肠癌存在微卫星不稳定。微卫星是重复单位为1-6bp的重复序列，数十万个微卫星位点遍及整个基因组。微卫星是遗传学图谱制作、法医个体鉴定、移植相容性检测等的重要标记。MSI是指由于缺失或插入重复单位引起肿瘤DNA与同一个体的正常胚系DNA相比微卫星长度发生改变，即产生异常长度的等位基因。MSI作为MMR缺陷的指标，是由复制错误引起，相对于胚系长度而言微卫星片段长度发生了缩短或延长。MSI的HNPCC发生的主要原因是生殖细胞的MMR基因突变。hMLH1,hMSH2，hMSH6和bPMS2等任何一个或几个MMR基因的失活都能导致MSI发生。散发结直肠癌病人多数仅有MMR基因体细胞突变。现在认为MSI的发生除了生殖细胞MMR基因的突变途径以外，还与启动子甲基化引起hMLH1表达缺失有关。在散发性结直肠癌中hMLH1启动子甲基化是MSI的重要机制。但在散发性结直肠癌中MSI的发生机制还未被完全阐明，相关的基因、路径等也可能与HNPCC不同。由于HNPCC和散发性结直肠癌的MSI发生机制上的差异，两者的临床意义也不同。MSI表型可分为两类：高频微卫星不稳定(MSI-high，MSI-H)和低频微卫星不稳定(MSI-low，MSI-L)。在散发性结直肠癌或在HNPCC中都能出现MSI-H。MSI-H的散发性结直肠癌大多数与表遗传学因素引起的MMR基因MLH1失活有关。与MSI-H肿瘤不同，MSI-L肿瘤与微卫星稳定(microsatellitestability，MSS)肿瘤相似，也通常是经染色体不稳定途径发生的。因此提示MSI-L肿瘤与MSS肿瘤只是在微卫星改变数量上不同，但没有本质上的差异。将来研究的一个方向是在非MSI-H肿瘤中评价特异性突变，力图寻找并识别MSI-L肿瘤和MSS肿瘤的细微差异。MSI状态可用于预测预后和指导治疗方案制定。抑癌基因失活引起的杂合性丢失(thelossofheterozygosity，LOH)是CRC发生的另一个重要过程。缺失突变或染色体丢失都可引起某一位点丢失一个等位基因而发生LOH。LOH作为另一个常见的微卫星改变的表型，在CRC发生中具有重要意义，分析LOH是一种发现候选抑癌基因的有效途径。为了识别CRC典型的遗传改变和寻找有用的标记物，我们对2007-2008年间的63例散发性结直肠癌与配对的正常粘膜上皮样本进行了研究。通过评价CRC患者的MSI频率和LOH情况，研究它们在散发性结直肠癌中的作用。文献报道采用不同类型和不同数量的标记检测同一种肿瘤，得到的微卫星频率结果可截然不同，这很可能与所选标记及检测方法的敏感度差异有关。为了使微卫星分析标准化，1997年美国国家癌症学会会议推荐了5个微卫星标记用于检测MSI，以及根据检测结果制定MSI分级指导方案。我们用多重荧光PCR结合ABI3130遗传分析仪进行毛细管电泳(capillaryelectrophoresis，CE)，检测并分析所推荐的5个微卫星位点：BAT25，BAT26，D2S123，D5S346和D17S250。我们检测了63例肿瘤的MSI情况并研究MSI和MSS病人的部分临床病理指标。2/5及以上的位点出现不稳定判为MSI-H。所有位点都稳定的为MSS。在这个研究中我们还分析了散发性结直肠癌5个位点的LOH情况。我们建立并优化了一套通过检测若干位点MSI情况的临床分子诊断方法。正常胚系和肿瘤样本经多重PCR扩增，PCR产物在毛细管电泳过程中依据大小不同被区分开，并识别肿瘤组织中长度异常的等位基因。这种基于多重PCR模式的检测方法优于以往的聚丙烯酰胺凝胶电泳、放射自显影等。CE是一种先进的荧光标记PCR扩增产物分析工具。这种方法最初用于法医鉴定，然而现在由于它敏感和相对快速的优点在临床检验工作中被日益重视。但由于多重荧光PCR-CE是一项精度要求相对较高的检测技术，因此实验操作中不少细节是影响检测成败的关键因素，并可能引起微卫星数据分析的错误解释。在研究过程中我们分析并找到了这些常见问题的解决方法，对该技术进行相应的优化。同时我们改良了从福尔马林固定组织中抽提DNA的方法，用于已知临床诊断的档案样本的MSI分析。而较久一些的样本因为结合临床跟踪随访而具有更高的价值。我们用这个方法抽提的DNA能用于多种分子研究，包括PCR反应、片段分析和直接测序等。由于DNA化学修饰以及随着时间的迁移而发生持续的降解等原因，从福尔马林固定组织中抽提质量高的DNA是比较困难的。福尔马林固定液加入组织后能使脂质分离、蛋白质变性以及细胞膜、染色体和DNA的脆性度大大增加。我们将改良法和常规酚-氯仿-异戊醇法抽提的DNA的浓度和质量进行了比较。改良方法抽提DNA在数量上与常规法相似，但在DNA的质量和抽提成功率上明显优于常规法。用琼脂糖凝胶电泳检验改良法抽提的DNA质量，得到的DNA片段大小都在500bp以上，大部分在1000bp以上。用5个MSI敏感标记分析散发性结直肠癌的MSI及LOH情况时，我们得到MSI总的检出率为34.92％(22/63)，其中MSI-H16例(25.4％)，MSI-L6例(9.52％)，MSS41例(65.08％)。这些结果显示MSI在散发性结直肠癌中可能是常见的事件。微卫星各位点突变率分别是D5S