primer design

引物设计•引物•引物的重要性•引物设计的原则•引物与PCR•引物设计软件•如何使用PrimerPremier5.0•引物设计实例引物（primers)•引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA模板链互补。→←3’3’5’5’SenseprimerAntisenseprimer引物的重要性•在整个PCR体系中,引物占有十分重要的地位。PCR的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的DNA结合，PCR的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物进行有效的延伸，可见引物设计好坏与PCR结果密切相关。引物设计原则•引物长度•碱基分布的均衡性•Tm值（熔解温度）•引物3’端•引物5’端•引物二级结构•引物二聚体•引物的保守性与特异性•扩增区域的二级结构特异、高效引物长度•一般为15-30个核苷酸，在做长片段PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物，但最多不超过50个核苷酸。碱基分布的均衡性•同一碱基连续出现不应超过5个•GC含量一般40-60%–GC含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火温度不利于提高PCR的特异性–GC含量太高也易于引发非特异扩增。引物Tm值（熔解温度）•一般要求：55℃-65℃。•计算：–对于低于30个碱基的引物，Tm值可根据Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算–对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学参数，从“最近邻位”的计算方式得到，这也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。•Tm=△H/(△S+R*ln(C/4))+16.6log([K+]/(1+0.7[K+]))-273.15引物3’端•引物的延伸从3’端开始，因此3’端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸。引物5’端•引物5’端可以有与模板DNA不配对碱基，在5’端引入一段非模板依赖性序列。–5’端加上限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5’端加上适当数量的保护碱基）。–5’端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变以作研究。–5’端标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。引物二级结构•发夹结构–尤其是要避免引物3’端形成发夹结构，否则将严重影响DNA聚合酶的延伸。3’5’5’3’引物二聚体•引物二聚体(Dimer)–尽可能避免引物自身分子之间3’端有较多碱基互补•上下游引物间二聚体(CrossDimer)–尽可能避免上下游引物分子之间3’端有较多碱基互补5’3’5’3’5’3’5’3’引物的特异性与保守性•特异性：避免非特异性扩增•保守性：通用引物——检测同一类病原微生物尽可能多的型别用Blastn软件进行分析比较扩增区域的二级结构•模板DNA的某些区域具有高度复杂的二级结构，在选择引物时，应使扩增区域尽可能避开这些区域。引物与PCR•引物浓度：一般为0.1-1μmol/L–引物浓度(uM)=nOD×33/（A×312＋C×288＋G×328＋T×303-61）/VH2OVH2O(单位：L)•退火温度–最适退火温度（TaOpt）=0.3×(Tmofprimer)+0.7×(Tmofproduct)–25–一般采用较引物Tm值低5℃作为PCR退火温度。•在0.2mLEppendorff管内配置50μL反应体系：反应物体积（μL）ddH2O35.5PCR缓冲液（10×）5MgCl2（25mmol/L）4dNTP（10mol/L）2.5Sense引物（10μmol/L）0.5Anti-sense引物（10μmol/L）0.5TaqDNA聚合酶1模板DNA1引物与PCR引物设计软件•PrimerPremier5.0•Primer3•DNAman•Oligo如何使用PrimerPremier5.0•引物设计–一般PCR引物设计（病原体检测）–带酶切位点引物设计（基因克隆）–RealtimePCR引物设计–巢式PCR引物设计–多重PCR引物设计•探针设计设计引物用于检测病例样本中是否存在结核杆菌感染引物设计实例MycobacteriumTuberculosisAg85a获取目标序列MycobacteriumTuberculosisAg85a上机实习•从NCBI上下载MycobacteriumTuberculosisAg85a基因序列•以该序列为模板设计一对用于扩增200～500bp序列的引物•以Excel订单形式提交引物