第12章-激光共聚焦显微镜术

第八章激光扫描共聚焦显微镜术光学显微镜作为细胞生物学的研究工具可以分辨出小于其照明光源波长一半的细胞结构。随着光学、视频、计算机等技术的发展而诞生的激光扫描共聚焦显微镜（laserscanningconfocalmicroscope，LSCM），使现代光学显微镜有能力研究和分析细胞在变化过程中的结构，特别是对活细胞离子含量变化的定量检测，这是以往的显微镜所望尘莫及的。第一节LSCM的结构和原理•1957年，MarvinMinsky提出了共聚焦显微镜技术的某些基本原理，获得了美国的专利。1967年，Egger和Petran成功地应用共聚焦显微镜产生了一个光学横断面。1977年，Sheppard和Wilson首次描述了光与被照明物体的原子之间的非线性关系和激光扫描器的拉曼光谱学。1984年，Biorad为公司推出了世界第一台商品化的共聚焦显微镜，型号为SOM-100，扫描方式为台阶式扫描。1986年MRC-500型改进为光束扫描，用作生物荧光显微镜的共聚焦系统。。随后Zeiss、Leica、Meridian、Olympus等多家公司相继开发出不同型号的共聚焦显微镜，应用的范围也越来越广泛。•一、LSCM的基本结构•LSCM是将光学显微镜技术、激光扫描技术和计算机图像处理技术结合在一起的高技术设备。其主要配置有激光器、扫描头、显微镜和计算机四大部分。包括数据采集、处理、转换及相应的应用软件，图像输出设备及光学装置，如光学滤片、分光器、共聚焦针孔及相应的控制系统（图8-1）。现以MRC-1024型LSCM为例进行介绍。•1．激光器采用的是气冷式氪-氩离子混合激光管，输出功率为15mW，激发光波长为488、568及647nm，激光束通过光纤电缆导入扫描头。•2．扫描头扫描头可以分为：①探测通道，由光电倍增管（photomultipletube，PMT）和相应共聚焦针孔及滤过轮组成；②滤光块，本机配有进行细胞标记用的T/1T2A滤光块，有测活细胞钙离子的B1及Open滤光块，测pH值及其它离子，可根据标本和目的进行不同选择；③扫描头，有管道与光学显微镜相连接。•3．光学显微镜可配置直立或倒置显微镜，MRC-1024型LSCM配置的是ZeissAxiovert100型倒置显微镜。镜头倍率和数值孔径是固定的。•4．计算机及界面•（1）计算机：硬件，内存32MB，硬盘12GB；软件，用于图像采集和分析的OS/2，Window5.0等和测定钙离子的Time-Course/Ratiometric等软件。•（2）MRC-1024共聚焦界面。硬件，24比特图像获得及显示卡；软件，Lasersharp等。•（3）显示器：17寸彩色监视器，分辨率1280×1024。•二、LSCM的工作原理•传统的光学显微镜使用的是场光源。由于光散射，在所观察的视野内样品的每一点都同时被照射并成像，入射光照射到整个细胞的一定厚度，位于焦平面外的反射也可通过物镜而成像，使图像的信噪比降低，影响了图像的清晰度和分辨率。此外，传统的光学显微镜也只能对局部作平面成像。LSCM采用激光束做光源，激光束经照明针孔，由分光镜反射至物镜，并聚焦于样品上，对标本内焦平面上的每一点进行扫描。然后，激发出的•荧光经原来入射光路直接反向回到分光镜，通过探测针孔先聚焦，聚焦后的光被光电倍增管增强，在检测小孔平面被探测收集，并将信号输送到计算机，在彩色显示器上显示图像。•在这条光路中只有在焦平面上的光才能穿过探测针孔，焦平面以外区域射来的光线在探测小孔平面是离焦的，不能通过小孔。因此，非观察点的背景呈黑色，成像也不清晰。由于照明针孔与探测针相对于物镜平面是共扼的，焦平面上的点同时聚焦于照明针孔和发射针孔，焦平面以外的点不会在探测针孔处成像，即共聚焦。以激光做光源并对样品进行扫描，在此过程中经过两次聚焦，故称为激光扫描共聚焦显微镜图8-1激光共聚焦扫描显微镜的原理（光路图）第二节LSCM的标本的处理•生物标本的范围很广，苯节主要指医学研究领域的组织或细胞标本。激光共聚焦显微镜可以观察石蜡切片、冰冻切片、涂片、印片、铺片，培养的贴壁细胞、悬浮细胞等。可根据不同的观察目的进行不同的染色。•一、取材•1．组织标本组织标本主要取之活组织检查标本、手术切除标本、动物模型标本以及尸体解剖标本。前三者均可为新鲜组织，后者一般是机体死亡2h以上的组织，组织细胞会有不同程度的自溶，细胞组织的生化成分和抗原成分有变性消失和严重的弥散。因此，对于新鲜采集或尸检标本同样要尽快处理，或立即速冻进行冰冻切片，或立即用固定液固定，进行脱水、浸蜡、包埋、石蜡切片。如不能迅速制片，可贮存于液氮或-70℃冰箱内备用。•2．细胞标本•(1)贴壁生长的培养细胞可直接进行固定、染色等处理。•(2)悬浮的培养细胞：沉淀涂片，细胞离心涂片器（cytospin），载玻片上涂粘附剂：如多聚赖氨酸（0.01%~0.5%），甲醛-明胶，铬矾明胶，Vectabond试剂。•(3)体液沉淀涂片法。•(4)穿刺吸取涂片法。•二、固定•要特别注意固定剂的种类、固定的时间、温度和pH。选择最佳固定液标准是最好地保持细胞和组织的形态结构；最大限度地保存抗原的免疫活性（一些含重金属的固定液在免疫组化和细胞化学技术中是禁用）；不要用可能带有自发荧光的固定剂，如带有苦味酸的固定剂，还有甲醛升汞固定液，会使上皮细胞产生非特异性荧光（参见有关章节）。•三、切片•由于激光穿透力强，所以用于激光共聚焦显微镜观察的切片厚度可放宽至40~50µm，切片不要太薄，以免结构的丢失。•1．冰冻切片为免疫组织化学染色中最常用的一种切片方法。其最突出的优点是能够比较完好地保存多种抗原的免疫活性，尤其是细胞表面抗原更应该采用冰冻切片。新鲜的组织及已经固定的组织均可作冰冻切片。冰冻切片后如果不染色，必须吹干，贮存于低温冰箱内，或进行短暂预固定后贮存于冰箱中。•2．石蜡切片其优点是组织结构保存良好，在病理和回顾性研究中有较大的实用价值，能连续切片（薄片），组织结构清晰，抗原定位准确。用于免疫组织化学技术的石蜡切片制备与常规制片略有不同，主要是要在比较低的温度下进行。•3．振动切片可以把新鲜组织（不固定不冰冻）切成20~100µm的厚片，以漂浮法进行染色。组织不冰冻，无冰晶形成和组织抗原破坏，在免疫组化染色前避免了组织脱水、透明、包埋等步骤对抗原的损害，能比较好地保留组织细胞内脂溶性物质和细胞膜抗原。•四、染色和封固•LCSM一般采用免疫荧光染色，具体方法参见荧光染色的有关章节。注意染色后要尽快观察，切片要避光保存。•封固常用甘油和0.5mol/LpH9.0~9.5的碳酸盐缓冲液的等量混合液。由于激光共聚焦显微镜观察采集图象很快，所以一般用PBS或生理盐水也可以。如需将染色后的样品保存一段时间，可以用指甲油在盖玻片周围封闭，暗处保存。•五、影响荧光组织细胞染色的因素•荧光染料是否发射荧光或荧光的强弱，主要决定于该染料的分子结构。同时，与它所处的环境及其状态也有密切关系，如:•1．pH值每种荧光素有其最适宜的pH值，改变pH值即可影响荧光素吸收光能的能力和发射荧光的强度。•2．染色溶液的浓度一般荧光色素的溶液极淡，增加浓度，荧光亮度也会随之增加，但溶液浓度增加到一定程度时，荧光亮度可达到最大。如果再增加浓度，荧光亮度反而会下降。这是因为由于溶液的浓度过大，色素分子间相互作用形成缔合分子，缔合分子本身起到了荧光淬灭剂的作用。•3．温度有些荧光色素在20℃时即开始出现荧光淬灭作用。温度越高淬灭作用越强，以至完全淬灭。所以荧光染色必须温度适当,才能获得良好的效果。荧光抗体一般在37℃或4℃下进行。FITC影响不大。•4．荧光淬灭物质•（1）卤酸盐，其中以碘离子作用最强，其次为溴离子，氯离子作用最小。•（2）具有氧化作用的物质如氨基苯、硝基苯等。•（3）某些金属离子，如铁离子、银离子等。•5．激发光强度物质的分子和荧光色素的结合键有一定强度，如果吸收的激发光能超过了它的结合键的结合力，很容易使结合键断裂，而造成荧光发生褪色（淬灭和漂白）。对之可降低激发光的强度第三节LCSM的主要功能一、图像分析•1．提高分辨率通过使用荧光素交联的抗体作为特异性的染料来测定细胞内的某些参数，在生物学研究中已获得普遍应用。但这一技术常存在不在焦平面上荧光的干扰，造成本底较高，而分辨不清组织结构的细节。由于LSCM的分辨率小于0.2µm，比普通光学显微镜高1.4倍，因此同一样品，用LSCM观察到的图像比普通光学显微镜清晰，观察荧光染料标记的样品，其效果更为明显。同时LSCM将高敏感性的光电倍增管（PMT）合为一体，并应用数字滤过，使信/噪比最佳化，排除了焦点以外的荧光干扰。•2．细胞CT共聚焦成像利用照明点与探测点共扼这一特性，可有效抑制同一焦平面上非测量点的杂散荧光及来自样品中非焦平面的荧光，不仅可获得普通显微镜无法达到的分辨率，同时具有浓度识别能力及纵向分辨率，因而可看到较厚生物标本的细节。它以一个微动步进马达控制载物台上下步进移动，其最小步距可为0.1µm，可以逐层获得高反差、高分辨率、高灵敏度的二维光学横断面图像，从而对生物样本进行无损伤的光学切片，得到各层面的数据，即“细胞CT”。这一技术克服人工切片的各种不足，并可将多层影像进行叠加，经计算机三维重建后得到样品的立体结构。这是LSCM的主要功能与优点之一。•3．三维重建图象三维重建后的图像不但能揭示细胞内部的结构，而且还可以提供细胞的立体数据，如将重组的图像旋转，随意观察细胞的各个侧面。也可研究细胞内亚微结构的立体形态学变化及其空间关系。同时LSCM还可研究细胞核和染色体的三维立体形态，借助光学切片功能测定细胞深层的荧光分布及细胞内各种物质的变化。如对DNA、RNA，蛋白质的含量，分子的扩散，细胞骨架等进行准确的定性、定量、定位。•LSCM还可用于测定细胞面积、细胞周长和细胞核面积、从而使形态学研究更为客观。同时通过改变观察角度还可以突出特征性的结构。•二、免疫荧光检测•在普通荧光显微镜，由于荧光图像在显微镜视野中的荧光亮度与物镜的数值孔径的平方成正比，与其放大倍数成反比，因此放大倍数越高，其影响越明显。但对荧光不够强的标本，为提高荧光图像的亮度，又必须使用数值孔径大的物镜。这样就不可避免地要以缩小视野作为代价，造成图像信息的损失。LSCM由于其高度的敏感性，以及其后期图像处理的强大功能，可以在使用较小数值孔径物镜的条件下获得良好荧光强度图像。•1．荧光定量测量•荧光显微镜凭工作者目力观察，判断荧光的强度一般分为四级：“0”无或可见微弱荧光；“+”仅能见明确可见的荧光；“++”可见有明亮的荧光；“+++”可见耀眼的荧光，这种判断方法带有很大的主观性。LSCM借助免疫荧光标记方法，与激光扫描、光学显微镜、计算机技术相结合，可对细胞内荧光标记的物质进行定性、定量监测。通过后期处理可对单标记或多标记的细胞或组织标本的荧光进行定量分析，同时还可将荧光像与定量图形重叠以显示荧光在形态结构上的精确定位。借助光学切片的功能可在毫不损失分辨率的条件下，测量标本深层的荧光强度，使实验数据更加充分和真实可靠。•2．荧光多重标记•荧光显微镜在进行多种标记物的观测时，需要更换特殊的滤片，以改变激发波长来达到观测目的。LSCM由于配有3个独立的PMT，可同时获取多种信号数据，24比特图像显示板可以使三色同时显示，所以可同时同屏采集和显示3个不同发射波长的荧光色和一个混合图像，可方便地进行双标或三标研究。如需要检测细胞膜、细胞核、细胞质内三种不同的物质，可采用三种不同荧光标记的抗体标记样品，经激光扫描、共聚焦采集数据后成像，即可在三个相应的部位观察到标记的抗体阳性反应，并有重叠图像显示相互的关系，同时可测得细胞的面积、周长，平均荧光强度、积分荧光强度以及胞质内颗粒的数目等，对细胞进行全方位的定量分析。•3．荧光摄影•荧光显微镜摄影对于记录荧光图像十分必要，由于荧光很容易衰减，需要及时地记录实验结果。虽然方法与普通显微镜摄影技术基本相同，但是需要采用ASA值在200或400以上的高速感