大肠杆菌表达系统-3

前言基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。基因工程主要目标之一是生产常规方法难以生产的大量蛋白质产物—即实现基因的高效表达。基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。第三章真核基因在大肠杆菌中的表达最佳的基因表达体系：⑴目的基因的表达产量高;⑵表达产物稳定;⑶生物活性高;⑷表达产物容易分离纯化。第一节基因的表达系统与表达策略宿主细胞的选择适合目的基因表达的宿主细胞的要求:1、容易获得较高浓度的细胞；2、能利用易得廉价原料；3、不致病、不产生内毒素；4、发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态；5、容易进行代谢调控；6、容易进行DNA重组技术操作；7、产物的产量、产率高，8、产物容易提取纯化。宿主细胞分为两大类：1、原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等；2、真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。一、真核基因的大肠杆菌表达体系目前，已被用于表达外源蛋白质的表达系统有细菌（大肠杆菌和枯草杆菌）、酵母、昆虫、植物和哺乳动物细胞等。但比较而言，大肠杆菌表达系统具有明显的优越性。大肠杆菌表达体系的优越性：1.对大肠杆菌的背景知识（完成基因组全测序），特别是基因表达调控的分子机理有深刻的了解（乳糖操纵子）；2.是一种安全的基因工程实验体系，拥有各类适用的寄主菌株和不同类型的载体；3.许多克隆的真核基因都可以在大肠杆菌细胞中实有效、高水平的表达；4.大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，易用于批量生产。大肠杆菌中表达体系的不足：1.真核基因在结构上同原核基因之间存在着很大的差别。2.真核基因的转录信号同原核的不同。细菌的RNA聚合酶不能识别真核的启动子；外源基因可能含有具大肠杆菌转录终止信号功能的核苷酸序列。3.真核基因mRNA的分子结构同细菌的有所差异，影响真核基因mRNA稳定性。4.许多真核基因的蛋白质产物，都要经过转译后的加工修饰（正确折叠和组装），而大多数的这类修饰作用在细菌细胞中并不存在；5.细菌的蛋白酶，能够识别外来的真核基因所表达的蛋白质分子，并把它们降解掉。6.大肠杆菌周质内存在各种内毒素。克隆基因正确表达的基本条件能够进行正常的转录和翻译，以及在正常情况下还与翻译后加工及新生多肽在细胞中的分布有关。启动子、终止子以及正确读码框（ORF）。二、大肠杆菌的表达载体1、大肠杆菌表达载体的基本成分TTGACA。。。。。TATAAT-3517-10PRTAAGGAGG（N）8ATG（91%）GTG（8%）TTG（1%）编码序列TAATGATAGTTtetrOriRBSRBS：ribosomebindingsite,核糖体结合位点SD外源基因在大肠杆菌中高效表达的原理•启动子•终止子•核糖体结合位点•密码子•质粒拷贝数•寄主生理状态转录水平翻译水平（1）启动子要使克隆的外源基因高水平表达的最佳启动子，必须具备以下几个条件：1）必须是一个强启动子。2）这个启动子应能呈现一种低限的基础表达水平。使用高度抑制型的启动子是一种极为重要的条件。（外源蛋白可能对细胞有害）3）这种启动子应是诱导型的，能通过简单的方式使用廉价的诱导物而得以诱导，如物理（如热）和化学（如IPTG）诱导。（2）转录终止子*当上游启动子驱动的转录作用通读过下游启动子时，便会使该启动子的功能受到抑制。—启动子封堵作用*在克隆基因编码区的3’-末端接上一个有效的转录终止子，便能够阻止转录通读。此外，转录终止子还能增强mRNA分子的稳定性，从而大大提高蛋白质产物的水平。（避免产生多余的二级结构）（3）翻译起始序列mRNA转录本5’端的独特的结构特征（核糖体结合位点），是决定mRNA翻译效率的主要因素。至今，仍未鉴定出通用有效的翻译起始序列的保守结构，但却已经发展出许多种可以用来有效地降低在mRNA转录本5’-末端形成二级结构的实验方法，从而提高克隆的外源基因的表达效率。例如:在RBS序列中增加AT含量；诱发特异碱基发生定点突变；以及使用翻译偶联系统进行克隆基因的表达。（4）翻译增强子大肠杆菌和噬菌体基因中存在一些特殊的序列元件，能够显著地增强异源基因在大肠杆菌细胞中的表达效率。这类特殊序列元件特称为翻译增强子。例如：T7噬菌体基因10的前导序列（g10-L）、以大肠杆菌atpE基因为代表的一些mRNA分子5’-UTR中的富含U的区段，以及直接位于T7基因起始密码子下游的“下游元件”等。分子机制不明。（5）翻译终止密码对mRNA翻译终止而言，一个必不可少的条件是必须存在终止密码子。因此，在构建大肠杆菌表达载体时，通常安置上全部的三个终止密码子，以便阻止发生核糖体的“跳跃”现象。已知大肠杆菌格外偏爱使用终止密码UAA，尤其是当连上一个U而形成UAAU四联核苷酸的情况下，翻译终止的效率进一步提高。2、常用的大肠杆菌表达载体迄今为止，基因工程学家已经设计并构建了一系列的以原核启动子取代真核启动子的质粒表达载体系统。最常用的：噬菌体的PL启动子，大肠杆菌的Lac启动子、Trp启动子，以及pBR322质粒的-内酰胺酶启动子等一批强启动子构成的。三、大肠杆菌的转化方法1、Cohen转化法1972年Cohen改进而成，是目前最常用的方法。操作步骤：（1）将处于对数生长期的新鲜培养物（0.5-0.6OD)，于4℃,4000转/分钟离心10分钟，回收细菌细胞；（2）将细胞用0℃的0.1mol/LCaCl2溶液重新悬浮细胞沉淀，以诱导细胞感受态产生；（3）加入适量的DNA后，于42℃热处理90秒；（4）将混合物快速转移到冰浴中，使细胞冷却1-2分钟，加入适当的培养基在37℃培养45分钟，使细胞复苏，并表达质粒所携带的转化基因；（5）选择培养基培养，选择转化体。2、Hanahan转化法1983年由Hanahan设计。它的特点是在感受态细胞的诱导方面，除了用CaCl2和MnCl2等二价离子按一定形式组合方式处理细胞外，还利用二甲亚砜（DMSO）、二硫苏糖醇（DTT）和氯化六氨合高钴等进一步处理细胞，其它方面与上法相同。这种方法的优点是形成高频率的感受态细胞，可使转化效率提高100-1000倍，而且对大小质粒都能进行有效的转化。值得注意的是：此法要求的条件高，对外界污染物极其敏感，对各方面的要求很高。因此，只在极少数情况下才使用此法。3、电转化法电转化法的转化效率受电场强度、电脉冲的时间和DNA浓度等参数的影响。转化效率：108-109转化体/µgDNA。•当电压和电脉冲时间的一定方式组合而导致50%-70%细菌死亡时，转化效率达到最高。•制备用于电转化的感受态细胞相对容易。当细菌长到对数中期，冷却、离心，然后用冷却的去离子水反复清洗，最后用10%甘油重悬细胞，使其浓度为31010细胞/毫升，在干冰或液氮中速冻后置于-70℃贮存。•转化必须在0-4℃下进行。如果在室温下操作，转化效率会大大降低。四、克隆的真核基因在大肠杆菌细胞中的表达1、外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的表达部位细胞质；细胞周质；分泌到细胞外这三种表达部位各有不同的优缺点，而且对表达量和表达产物的制备有很大关系。在大肠杆菌细胞不同部位表达外源蛋白质的优缺点表达部位优点缺点细胞质1、形成包涵体1、蛋白质折叠了可能无法恢复起生物学活性（1）蛋白质易于以高纯度和高浓度方式分离2、还原的环境不利于二硫键的形成（2）蛋白质受保护而免受胞内酶的降解（3）蛋白质没有活性，不会使细胞受伤害2、表达的质粒载体构建比较简单周质1、周质中蛋白质种类较少，纯化简单1、信号肽并非总是有助于蛋白质的转运2、蛋白质酶解程度不严重2、有可能形成包涵体3、促进二硫键的形成及蛋白质的折叠4、蛋白质N-末端结构真实胞外1、蛋白质的酶解作用程度很底1、在大肠杆菌细胞中表达的外源真核蛋白通2、目标蛋白的纯化容易，由于分泌到胞外的常不会分泌到胞外蛋白种类少2、由于分泌到胞外的蛋白质相当于稀释，因3、增进了蛋白质的折叠作用此目标蛋白的得率较低4、蛋白质N-末端结构真实*Talmadge和Gilbert（1982）将外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的不同部位表达。结果：细胞质中表达的大鼠胰岛素原的半衰期仅有2min左右，而表达在大肠杆菌周质中大鼠胰岛素原的半衰期延长了10倍以上。（原因：细胞周质中蛋白酶的含量低）到目前为止，这方面的技术还很不成熟，外泌率低。*使克隆基因表达的外源蛋白质分泌到胞外的培养基中，是获得蛋白质稳定性的最佳途径。2、外源蛋白质在大肠杆菌细胞中的稳定性当一种克隆的外源基因在大肠杆菌中不能实现其功能表达时，我们往往会认为这是由于转录或翻译过程发生了问题。其实在早期的研究中就有许多实验表明，克隆的外源基因即便是在大肠杆菌中得到了表达，也并不一定就意味着它的多肽产物是稳定的。影响因素包括：（1）蛋白质的降解作用在大肠杆菌的细胞中，含有大量的各种类型的蛋白酶，广泛分布在细胞质、周质、内外膜等部位，参与许多方面的代谢活动，包括选择性地酶解异常的蛋白质。已知有许多因素，如不完全多肽、氨基酸取代突变、多酶复合体亚基的超量合成、氧化作用或游离自由基的作用而造成的翻译后损伤，以及基因工程技术的效应等，都可以导致蛋白质分子受损或构型变化，形成异常蛋白质。为了避免在大肠杆菌中发生外源蛋白质的降解，或将此降解作用控制在最低水平，已针对性发展出了许多种不同的技术方案。主要有：1）让外源蛋白质定位在周质或胞外表达；2）使用蛋白酶缺陷的大肠杆菌做表达菌株；3）将转化有克隆基因的寄主菌株放置在低温环境中生长；4）使目标基因以融合蛋白形式表达；5）置换多肽链中某些氨基酸，消除蛋白酶切点；6）对目标蛋白质作疏水性修饰。（2）结构决定因子与蛋白质的稳定性•与蛋白质稳定性相关的确切的分子结构特征？不清楚•但已经明确了若干种影响蛋白质稳定性的结构决定因子。其中最重要的：N-端氨基酸性质。N-端氨基酸性质“N-端法则”:在生物体内蛋白质新陈代谢的稳定性，主要取决于N-端氨基酸的性质。在大肠杆菌细胞质内，若蛋白质N-端为Arg、Lys、Leu、Phe、Tyr和Trp等残基，则其稳定性较差（半衰期2min）；而同样条件下，若N-端为除了Pro之外的其它氨基酸残基时，其稳定性则大大提高（半衰期大于10h）。§重组操作时，N-端加一个增加稳定性的氨基酸（3）表达融合的蛋白质以形成融合蛋白的形式在大肠杆菌细胞中表达外源真核基因具有许多方面的优越性。例如，产物比较稳定，可以免受胞内蛋白酶的降解作用，可以获得较高的产率。谷胱甘肽Ｓ-转移酶（GST）、麦芽糖结合蛋白（MBP）以及硫氧还蛋白（Trx）均已经被证实能非常成功地生产正确折叠、有生物活性的蛋白质，能明显提高在E.coli细胞质中产生的融合蛋白的可溶性，并能抑制包涵体的形成。通过特定的纯化方法，可将融合蛋白与细胞污染物分开。通过溴化氰或蛋白酶裂解的方法对融合蛋白进行位点特异性裂解以获得天然蛋白。（4）分子伴侣（molecularchaperone）稳定作用分子伴侣：指一类多功能蛋白质，它能够通过阻止诸如聚合作用这样的副反应，来促使其它蛋白质按正确的方式折叠，而其本身却不是最终形成的功能蛋白质的组成成分。通过分子伴侣与克隆的外源基因在大肠杆菌寄主细胞中共表达是增强目标蛋白的稳定性、实现高水平表达的有效方法。（5）大肠杆菌突变体菌株与蛋白质的稳定性通过产生融合蛋白途径增加外源多肽稳定性的方法，已有许多文献报道，但此法的一个突出缺点是所产生的融合蛋白并不一定都能够在体外将天然蛋白质完整无损地切割下来。一种有效的变通办法是，使用胞内蛋白酶含量很低的大肠杆菌突变株。比如lon-（黄嘌呤核苷）营养缺陷型的大肠杆菌突变株。五、影响克隆基因在大肠杆菌中表达效率的因素启动子的强度、DNA转录起始序列、密码子的选择、mRNA分子的二级结构、转录的终止、质粒的拷贝数以及质粒的稳定性和寄主细胞生理特征等都会不同程度地影响克隆基因的表达效率。1、启动子对克隆基因表达效率的影响(1)启动子结构对表达效率的影响大肠杆菌启动子的序列结构具