细胞数的测定(血球计数板的使用方法)

细胞数的测定一、目的与要求了解血球计数板计数的原理，学会测定细胞总数方法。二、原理用血球计数板在显微镜下直接计数是一种常用的微生物计数方法。血球计数板是一块特制的厚载玻片，其上由四条槽构成三个平台，中间较宽的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分为9个大方格，中间的大方格即为计数室。计数室的刻度一般有两种规格，一种是一个大方格分成16个中方格，每个中方格又分成25个小格（即16x25），另一种是一个大方格分成25个中方格，每个中方格又分为16个小方格（即25×16），但无论是哪一种规格的计数板，每一个大方格中的小方格都是400个，每一个大方格边长为1mm，则每一个大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与载玻片之间的高度为0.1mm，所以计数室的容积为0.1mm3三、血球计数板的使用方法（一）菌悬液的制备为便于计数，对样品进行适当稀释，稀释程度以每小格内含5～10个酵母为宜，可采用10倍系列稀释法。（二）加菌悬液样品将清洁干燥的血球计数板盖上盖玻片，再用无菌的毛细滴管将摇匀的菌悬液由盖玻片边缘滴一小滴，让菌液沿缝隙靠毛细渗透作用自动进入计数室，用吸水纸吸去多余水液。由盖玻片边缘或槽内加入计数板来回推压盖玻片，使其紧贴在计数板上，计数室内不能有气泡。静置5-10分钟。（三）显微镜计数在低倍镜下找到小方格网后更换高倍镜观察计数，上下调动细螺旋，以便看到小室内不同深度的菌体。位于分格线上的菌体，只数两条边上的，其余两边不计数。如数上线就不数下线，数左边线就不数右边线。当芽孢菌体达到母细胞大小的二分之一时，可记作两个细胞。（四）计数时若使用刻度为25×16（大格）的计数板，则数四角的4个大格（即100小格）内的菌数。如用刻度为16×25（大格）的计数板，除数四角的4个大格外，还需数中央1个大格的菌数（即80小格）。每小格中菌数以5-10个为宜，如菌液过浓可适当稀释。（五）每个样品重复计数2-3次，取其平均值，按下式计算样品中的菌数。（六）计数完毕，将计数板在水龙头下冲洗干净，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干或用电吹风吹干。计数时，如果使用16×25的计数板，要按对角线方位取左上、左下、右上、右下上述4个中格进行计数（即计数100个小格中的细胞数）,如果使用25×16规格的计数板，则除了计数上述4个中格外，还要计数中央的1个中格，即计数80个小格中的细胞数，分别按下述公式计算出细胞数。（1）16×25格的血球计数板计算公式：1mL细胞数＝---------------------×400×104×稀释倍数（2）25×16格的血球计数板计算公式：1mL细胞数=-----------------------×400×104×稀释倍数四，材料与仪器菌悬液，显微镜，血球计数板，载玻片，盖玻片，接种环，吕氏美蓝五、实验报告次数12中格序号左上左下右上右下中左上左下右上右下中细胞数细胞总数