Waters Styragel柱子的维护与使用手册-2

WatersStyragel柱子的维护与使用手册柱子的维护与使用手册柱子的维护与使用手册柱子的维护与使用手册声明：禁止在未经允许下修改本资料，并且不应理解为是Millipore公司的承诺。对本资料中出现的错误M公司不承担任何责任。这本手册在出版期间是完整和准确的。M公司不负责由于本手册的使用带来的任何损失。1993年Millipore公司美国出版版权所有本手册或其中部分理论在没有经过出版者的允许禁止复制。M，Styragel，Fluoropore和Millex是M公司的注册商标，Waters是M公司的注册商标。1、、、、介绍介绍介绍介绍本手册介绍的是WatersStyragelHR、HT和HMW系列凝胶渗透色谱柱的使用和维护。请仔细阅读本手册，遵循本手册的建议将会延长柱子的寿命并加强色谱图的重现性。本手册描述了WatersStyragel色谱柱的以下三类：StyragelHR；StyragelHT；StyragelHMW。WatersStyragel柱子的填料为高性能、多孔、高交联度的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物颗粒。他们的不同性能使你能够选择最优的柱子来满足实验应用。WatersStyragelHR：可用于低分子量、低聚物和添加剂的高分辨分析。该柱装填5µm颗粒，能够提供此种分析类形所需的高塔板数。StyragelHT：可用于分析中等分子量范围聚合物的分析。他们是分子量分析中用途最多的。该柱装填10µm颗粒，在较宽的温度范围和溶剂范围内均有可靠的性能。StyragelHMW：专门用来分析超高分子量聚合物。装填有20µm颗粒和10µmHMW玻璃原料的该柱子能够有效防止由于剪切而对超高分子量聚合物造成的破坏，这种剪切往往出现在聚合物与小颗粒之间。2、、、、安装色谱柱组安装色谱柱组安装色谱柱组安装色谱柱组本章概述：准备GPC/HPLC系统；安装色谱柱；维修破坏的压紧螺丝；平衡色谱柱。2.12.12.12.1准备准备准备准备GPC/HPLCGPC/HPLCGPC/HPLCGPC/HPLC系统系统系统系统在将色谱柱接到GPC/HPLC系统流路前，应该先准备系统：1、用零死体积（我的理解为两通）单元代替以前的色谱柱，将进样器直接与检测器相连。2、更换系统试剂为色谱柱储存用溶剂。对于新色谱柱，即为封存试剂。3、冲洗系统从而去除微小粒子和旧的溶剂。如果可以的话，冲洗进样环。Bandspreading：在任何色谱系统中，连接管和接头都会造成额外的柱谱带扩展。在安装柱子前，要先测定你的系统仪器谱带扩展（详见5.3.1，测定仪器谱带扩展）。如果无法实现对此系统的测试，请查阅系统操作手册。2.2安装色谱柱安装色谱柱安装色谱柱安装色谱柱使用每根柱子提供的U形柱连接管连接一系列色谱柱。色谱柱组中柱子的顺序色谱柱组中柱子的顺序色谱柱组中柱子的顺序色谱柱组中柱子的顺序：一般来讲，分析结果与色谱柱组的连接顺序是无关的。但是，为了提高色谱柱的分离能力和柱子的寿命，会按照孔隙由大到小的顺序进行排列，也就是将最大孔隙的柱子靠近进样器。这样推荐的理由是：孔隙大的色谱柱更加粗糙并且更耐外来杂质的污染。样品的粘度主要来自于高分子量部分。如果高分子量物质先被分离，则粘度会下降的更快，这样就会减少对柱子组的损伤。在超高分子量聚合物的情况下，对样品就会产生更小的剪切。在色谱柱组中安装色谱柱：1、拿掉每根柱子的端塞并妥善保存。2、将第一根色谱柱与进样口出口管连接。确认溶剂的流动方向与柱子上标识的箭头方向一致。用手将螺丝拧紧，然后用扳手再拧紧4/1圈。3、用U形管将下一个色谱柱与前一个色谱柱连接起来。确保溶剂流动方向与柱子标识箭头方向一致。用手将U形管的入口和出口螺丝拧紧，然后用扳手再拧紧1/4圈。4、重复3直到所有色谱柱安装完毕。5、将最后一根色谱柱与检测器入口管连接起来。2.3修复损坏的压紧螺丝组合修复损坏的压紧螺丝组合修复损坏的压紧螺丝组合修复损坏的压紧螺丝组合移去损坏的压紧螺丝或一个坏的金属箍：1、用割管器或带有切削刃的锉刀将需要破坏的位置四周划线。2、用被布包裹的钳子将划线的两边夹紧。慢慢的使管来回移动直到它在划的界限处分离。确保管的根部是直的，开口的，没有毛边。3、滑动压紧螺丝和金属箍。适当地测量出接头在管路中的位置。如果管路没有完全在恰当的位置，就会产生死体积从而导致差的色谱图。对于不同类型的色谱柱，金属箍的末端与U型管的末端的距离是不同的。如果你使用的是其它公司的色谱柱，那么就需要重新定位金属箍的位置，或重新制作一个接头（如图一所示）。对于所有的管路，选择内径为0.009英寸（0.25毫米）的管子将注射器与检测器相连。对于Waters柱子，一般的距离是0.13英寸（2.25毫米）。2.4平衡色谱柱系统平衡色谱柱系统平衡色谱柱系统平衡色谱柱系统当你安装色谱柱系统和在储存后使用时要平衡柱子。为了平衡色谱柱系统，需要：1、设定泵流速为0.0mL/min,然后打开泵。2、将流速以每15秒提高0.1mL/min的速度将流速升至设定值。3、用封存柱子的试剂冲洗色谱柱至基线稳定。流速及柱后压力流速及柱后压力流速及柱后压力流速及柱后压力：：：：为了保持柱子的最佳分离能力和最长的柱子使用寿命，不要将流速超过1.0mL/min或者每根柱子的压力不要超过3.5MPa（500psi，35atm）。（当使用HR0.5，HR1和HR2色谱柱时，需要将流速以0.1mL/min速度增加到1mL/min。每增加一次要使压力平衡15s）性能差色谱柱系统性能差色谱柱系统性能差色谱柱系统性能差色谱柱系统：：：：在一个色谱柱系统中，如果有一个或多个色谱柱有缺陷，那么整个色谱柱组都会有缺陷。一个不合格的色谱柱会使峰扩展，并且再多的好的色谱柱也是无法弥补这一缺点的。典型色谱柱的柱效信息参照表3、4、5。初始柱效检测初始柱效检测初始柱效检测初始柱效检测：：：：在第一次分析前请检测您的色谱系统。将系统设定为推荐值，检测样品并记录结果。这些结果可以当做比较将来柱效的基线。具体的柱效及系统测定步骤，请参见5.3。保存测试的谱图。对于柱效检测，记录下保留时间，系统设定，和所有实验条件，这样才能在今后的对比中准确的重现。3溶剂与样品的准备溶剂与样品的准备溶剂与样品的准备溶剂与样品的准备本章描述以下内容：试剂的准备；更换流动相；更换色谱柱至高温溶剂下；准备样品。3.1准备溶剂准备溶剂准备溶剂准备溶剂为了能够得到可以重现的检测结果和维护操作，请使用干净的溶剂。使用液相色谱级溶剂，将大于0.45微米的颗粒过滤去除掉。沃特世的有机溶剂过滤装备是实现这一目的理想的选择。3.2更换溶剂更换溶剂更换溶剂更换溶剂溶剂的兼容性溶剂的兼容性溶剂的兼容性溶剂的兼容性：：：：Waters聚苯乙烯凝胶柱封存在你选择的溶剂中：甲苯、四氢呋喃或者N，N二甲基甲酰胺。一些应用需要不同的溶剂。改变溶剂最好在兼容的溶剂中进行。溶剂的兼容性如下表：转变到的溶剂封存柱子的溶剂二氯苯甲苯三氯苯甲苯苯酚/三氯苯甲苯γ-丁内酯四氢呋喃六氟异丙醇四氢呋喃正甲基吡咯烷酮N，N-二甲基甲酰胺甲苯酚N，N-二甲基甲酰胺如果在诸如三氯苯、邻二氯苯为溶剂的体系下，用Waters的聚苯乙烯凝胶色谱柱做高温色谱，需要在高温条件下更换流动相。高温转换流程高温转换流程高温转换流程高温转换流程：：：：将色谱柱系统转换成高温的操作：1、在室温下将色谱系统转换至封存色谱柱用的溶剂；2、在0.2mL/min的流速下用封存柱子的溶剂冲洗色谱柱，然后在至少3小时内，逐渐将温度升至90℃。（当将四氢呋喃溶剂转换为六氟异丙醇或γ-丁内酯时，设定系统温度在55℃）。3、在系统温度升至90℃时，以0.1mL/min流速改变至高温溶剂，每根柱子使用12mL。然后在0.2mL/min的条件下冲洗系统，冲洗体积至少为四倍柱子的体积。（如果使用的是一组色谱柱，用说明书上介绍的柱体积乘以柱子的数量即可）。4、在至少4小时内将温度增加到最终的使用温度，此时继续保持流速为0.2mL/min冲洗色谱柱。温度不要超过150℃。5、最后调节流速至最终的操作条件。优选的流速是1.0mL/min。返回室温返回室温返回室温返回室温：：：：先将流速降至0.1mL/min，然后以每30分钟10℃的速率降至室温。重新使用色谱柱重新使用色谱柱重新使用色谱柱重新使用色谱柱：：：：保持流速在0.1mL/min,将柱温升至需要的温度维持10小时以上。然后将流速升至需要的数值。（为了延长柱子的使用寿命，避免温度循环。当柱子不使用时，维持柱子的使用温度，将流速降至0.1mL/min.）3.3样品的制备样品的制备样品的制备样品的制备好的样品制备能够延长柱子的使用寿命并确保可重现的结果。需要注意的影响因素有：柱容量、样品粘度、检测器的种类及灵敏度。使用0.45μm有机滤膜将细小的颗粒物滤掉。活性聚合物活性聚合物活性聚合物活性聚合物：：：：一些活性聚合物（如环氧树脂）会“定义色谱柱”。通过将用于活性聚合物的色谱柱进行特殊分类，能够提高柱子的使用寿命及重现性。样品浓度：样品的浓度即会影响粘度也会影响进样体积。低样品量会产生较窄的色谱峰，粘稠样品可能需要加倍的稀释样品。表1列出了得到较优结果的推荐配置的样品浓度。高分子量聚合物高分子量聚合物高分子量聚合物高分子量聚合物：：：：高分子量聚合物特别容易受到粘度问题的影响。当分析高分子量聚合物时，使用表1给出的浓度。运行窄分布聚合物时（如：聚苯乙烯标样），样品浓度为0.02%，进样量为每根色谱柱50μL。分子量大约在400万或更高的聚苯乙烯标样更容易在溶剂中受到剪切的影响而降解。剪切的存在会使分子量分布比预期的宽。如果处理得当的话，即使分子量在2000万的聚合物也可以成功地分析。表1建议的样品浓度分子量范围样品浓度0-25000《0.25%25000-2000000.1%200000-20000000.05%大于20000000.02%超高分子量聚合物超高分子量聚合物超高分子量聚合物超高分子量聚合物：：：：对于大多数超高分子量聚合物剪切力也是需要考虑的一个因素。剪切力对超高分子量聚合物的影响不会像窄分布标样的影响那样容易观察。超高分子量的聚烯烃片段更容易发生剪切或形成沉淀。利用稀溶液（例如0.02%）进样可以减少沉淀。4444柱子的使用柱子的使用柱子的使用柱子的使用4.14.14.14.1色谱指导方针色谱指导方针色谱指导方针色谱指导方针凝胶渗透色谱柱的使用寿命与它的保养和使用有关。样品和溶剂的污染、频繁的更换溶剂、不当的操作和存储以及温度的循环都会缩短柱子的使用寿命。色谱柱使用指导方针：当使用WatersStyragel系列色谱柱时，遵守以下指导方针：A、如果想得到最佳的分辨效果和最长的柱寿命，不要让流速超过2mL/min或者每根柱压不要超过500psi。这些柱子的正常流速是1mL/min。B：防止柱子发生振动或机械震动。C：最小化温度循环。D：防止柱子由于迅速改变流动相组成而导致的压力突变。F：如果要更换至另一种粘度的流动相，有必要调节流速使柱压保持在每根色谱柱500psi以下。G：使用流动相来溶解样品以防止沉淀产生。H：一定要使用高品质色谱溶剂。I：色谱柱要专用。频繁的更换样品和溶剂会加速降低柱效和分辨度的下降。4.4.4.4.2222校准色谱柱校准色谱柱校准色谱柱校准色谱柱无论是更换单个色谱柱还是整个色谱柱组，都要重新制作校准曲线，以保证应用的重现性。图2、图3和图4展示了不同色谱柱系列的典型校准曲线。校准曲线以聚苯乙烯为标样获得。5555、、、、保养和维护保养和维护保养和维护保养和维护本章包含三部分：问题解决、存放色谱柱、柱效测试。5.15.15.15.1问题解决问题解决问题解决问题解决：：：：表2描述了特定问题描述、原因和正确的处理方法。问题原因正确处理方法操作柱压升高入口过滤器被颗粒物堵塞进样器和泵密封脱落更换过滤膜。在第一根柱子与泵之间安装一个在线过滤装置。过滤样品。管路被堵更换管路分离度下降、峰过滤器部分被堵塞更换或清洗过滤器进出口变宽、塔板数降低进样器损坏修理进样器平衡不够继续