酶的化学修饰

酶工程第一章绪论第二章酶的基础知识第三章酶分子的化学修饰第四章酶的生产第五章酶的分离纯化第六章酶的固定化第七章酶反应器第八章核酶和抗体酶第三章酶的化学修饰第一节什么是酶分子修饰第二节化学修饰的原理第三节酶化学修饰的基本要求和条件第四节酶分子的修饰方法第五节修饰酶的性质及特点第六节酶化学修饰的应用什么是酶分子修饰?通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的某些特性和功能的技术过程称为酶分子修饰。即：在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团，特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，或除去酶分子中的某些集团，从而改变酶的结构和性质。酶分子的化学修饰稳定性不够，不能适应大量生产条件的需要。作用的最适条件不符。酶的主要动力学性质的不适应。临床应用的特殊要求。酶在应用中可能出现的问题:酶分子改造的方向核酸水平：利用基因操作技术对DNA或mRNA进行改造或修饰，以期获得化学结构（一级结构和空间结构）更为合理的酶。——生物酶工程内容之一蛋白质水平：人们用化学法或酶法对酶的一级结构进行改造，这包括酶的一级结构中氨基酸的置换，包括用酶将肽链切断或部分切除，使酶的空间构象变得更为稳定。另一方面是对酶分子中氨基酸残基的修饰，即酶的化学修饰。酶分子的化学修饰定义：广义上说：凡涉及共价键的形成或破坏的转变都可以看作是酶的化学修饰。狭义上说：是指在较温和的条件下，以可控制的方式使酶同化学试剂发生特异反应，从而引起单个氨基酸残基或功能发生共价的化学变化。酶化学修饰的目的1.研究酶的结构与功能的关系。（50年代末）2.人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用范围。（70年代末之后）1）提高酶的生物活性（酶活力）。2）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）。3）消除抗原性（针对特异性反应降低生物识别能力）。4）产生新的催化能力。第二节.酶化学修饰的基本原理*1．如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性2．如何保护酶活性部位与抗抑制剂3．如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶4．如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境酶化学修饰的原理一、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性修饰剂分子存在多个反应基团，可与酶形成多点交联。使酶的天然构象产生“刚性”结构。二、如何保护酶活性部位与抗抑制剂大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶的活性部位。三、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解酶酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：1.大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶接近酶分子。“遮盖”酶分子上敏感键免遭破坏。2.酶分子上许多敏感基团交联上修饰剂后，减少了受蛋白水解酶破坏的可能性。四、如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境1.酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成了共价键。破坏了抗原决定簇——抗原性降低乃至消除“遮盖”了抗原决定簇——阻碍抗原、抗体结合2.大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表面形成“缓冲外壳”，抵御外界环境的极性变化，维持酶活性部位微环境相对稳定。第三节酶化学修饰的基本要求和条件一．修饰剂的要求二．酶性质的了解三．反应条件的选择四．酶修饰方法一．修饰剂的要求1．修饰剂具有较大的相对分子量；对蛋白质的吸附有良好的生物相容性和水溶性。2．修饰剂分子表面具有较多的活性反应基团。3．修饰剂上反应基团的活化方法与条件。了解被修饰酶的性质酶的稳定性：包括热稳定性、酸碱稳定性，作用温度以及pH，酶蛋白解离时的电化学性质，抑制剂的性质等。酶活性中心的状况：包括酶分子活性中心的组成，如参与活性中心的氨基酸残基、辅因子等。酶分子的形状、大小以及寡聚酶的亚基组成。二.酶化学修饰的基本要求①pH与离子强度：一般在酶稳定的条件下进行，尽可能减少破坏酶的必需集团，选择酶与修饰剂的结合率和酶活回收率都较高的反应条件。pH决定了酶分子中反应基团的解离状态，酶的解离状态不同，其反应性能也不同；另一方面，有些修饰试剂在不同pH下，与同一种基团反应可以形成不同的产物。离子强度对修饰反应也有重要影响。②修饰反应的温度与时间：严格控制反应温度和时间可以减少或消除一些非专一性的修饰反应。③反应体系中酶与修饰剂的比例：酶与修饰试剂的比例可以控制酶分子的修饰程度。三、选择修饰反应条件(1)酶的表面修饰(2)酶分子的内部修饰(3)与辅因子相关的修饰(4)金属酶的金属取代第四节.酶分子的化学修饰方法*⑦反相胶团微囊化⑥脂质体包埋⑤分子间交联④分子内交联③酶的大分子修饰作用②酶的小分子修饰作用①化学固定化(1)酶的表面修饰（1）酶的表面修饰①化学固定化：一般是直接通过酶表面的氨基酸残基将酶分子共价连接到惰性载体上；由于载体的引入，使酶所处的微环境发生改变，进而改变了酶的性质，特别是动力学性质发生了改变。②酶的小分子修饰作用：主要是利用一些小分子修饰试剂，通过共价结合来修饰酶的一些基团（如-COO-、-NH3+、-SH、-OH、咪唑基等），提高酶的稳定性。常用的小分子修饰试剂有乙基、糖基和甲基等。例如:将α—胰凝乳蛋白酶表面的氨基修饰后，酶的热稳定性在60℃时，提高了1000倍，温度更高时稳定化效应更强烈。这个稳定的酶能经受灭菌的极端条件而不失活，因而有利于医疗用酶。③酶的大分子修饰作用：可分为非共价修饰和共价修饰两大类：大分子非共价修饰：大分子共价修饰：大分子非共价修饰：利用一些大分子试剂通过与酶非共价相互作用，对酶进行有效的保护。•例如聚乙二醇、右旋糖苷等通过氢键固定于酶分子的表面，同时又有效地与外部水相连，从而保护酶的活力；•一些多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护酶活力；•另外一些蛋白质可以通过相互作用，排除分子表面的水分子，降低介电常数，使酶的稳定性增加。大分子共价修饰：利用一些可溶性大分子，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层，形成的可溶性酶具有许多有用的性质。•例如用聚乙二醇共价修饰超氧化物歧化酶（SOD），不仅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了半衰期，从而提高了药效。大分子（共价）修饰的过程•①修饰剂的选择根据酶分子的结构和修饰剂的特性选择适宜的水溶性大分子。•②修饰剂的活化修饰剂中含有的基团需要经过活化才可以与酶分子的某侧链基团进行反应。•③修饰将带有活化基团的大分子修饰剂与经过分离纯化的酶液，以一定的比例混合，在一定的温度、pH值等条件下反应一段时间，使修饰剂的活化基团与酶分子的某侧链基团以共价键结合，对酶分子进行修饰。•④分离需要通过凝胶层析等方法进行分离，将具有不同修饰度的酶分子分开，从中获得具有较好修饰效果的修饰酶。④分子内交联：增加酶分子表面的交联键数目是提高酶稳定性的有效方法之一，例如胰凝乳蛋白酶上的羧基经过羰二亚胺活化后，可以与一系列二胺发生作用，使酶的稳定性得到改善。⑤分子间交联：利用一些双功能或多功能试剂将不同的酶交联在一起形成杂化酶。例如用戊二醛把胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶交联在一起，可以降低胰凝乳蛋白酶的自溶性；将胰蛋白酶与碱性磷酸脂酶交联形成的杂化酶可作为部分代谢途径的模型。⑥脂质体包埋：一些医药用酶，如SOD、溶菌酶等，由于分子量较大，不易进入人体细胞内，而且在体内半衰期短，产生免疫原性反应；用脂质体包埋法即可解决这些问题。脂质体是天然脂类或类固醇组成的微球体，酶分子包埋在其内部，可以通过与细胞的膜融合或内吞作用而进入细胞内。⑦反相胶团微囊化：这是近年来发展起来的酶在有剂相中进行催化的技术，反相胶团中酶的稳定性大大提高；一些表面活性剂溶解在非极性有机溶剂中时可自发地形成近似球状的反相胶团，反相胶团是表面活性剂的疏水尾部朝外而极性头部朝内的微胶团，其内部可容纳一定量的水，酶溶解在其中避免变性（见图）。有机溶剂疏水尾部亲水头部加酶液SPEEE图：反相胶团的结构和酶的分布⑦反相胶团微囊化⑥脂质体包埋⑤分子间交联④分子内交联③酶的大分子修饰作用②酶的小分子修饰作用①化学固定化(1)酶的表面修饰(1)酶的表面修饰(2)酶分子的内部修饰(3)与辅因子相关的修饰(4)金属酶的金属取代酶分子的化学修饰方法(2)酶分子的内部修饰①非催化活性基团的修饰：通过对非催化残基的修饰可以改变酶的动力学性质，改变酶对特殊底物的亲和力；通常可被修饰的氨基酸残基既可以是亲核的，也可以是亲电子的，还可以是可氧化残基。②催化活性基团的修饰：通过选择性修饰催化活性氨基酸的侧链来实现氨基酸残基的取代，使一种氨基酸侧链转化为另一种氨基酸侧链，这种方法又称为化学突变法。③酶蛋白主链的修饰：主要是靠酶法进行修饰，用蛋白酶对主链进行部分水解，可以改变酶的催化特性。④肽链伸展后的修饰：酶蛋白经过脲、盐酸胍处理，使肽链充分伸展，对酶分子内部的疏水基团进行修饰，然后在适当条件下，重新进行折叠。(1)酶的表面修饰(2)酶分子的内部修饰(3)与辅因子相关的修饰(4)金属酶的金属取代酶分子的化学修饰方法(3)与辅因子相关的修饰对依赖辅因子的酶可用两种方法进行修饰：如果辅因子与酶是非共价结合的,可以将辅因子共价结合于酶分子上；引入新的具有更强反应的辅因子。(1)酶的表面修饰(2)酶分子的内部修饰(3)与辅因子相关的修饰(4)金属酶的金属取代酶分子的化学修饰方法(4)金属酶的金属取代：把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法。适用范围：–只适用于那些在分子结构本来含有金属离子的酶。–用于金属离子置换修饰的金属离子，一般都是二价金属离子。若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性。如果重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或者部分恢复。若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至丧失，有的却可以使酶的活力提高或者增加酶的稳定性。金属B金属离子置换修饰的过程①酶的分离纯化②除去原有的金属离子③加入置换离子发酵液酶分离纯化A酶EDTAEDTA-A+酶B(1)酶的表面修饰(2)酶分子的内部修饰(3)与辅因子相关的修饰(4)金属酶的金属取代酶分子的化学修饰方法*酶分子侧链基团的化学修饰•一．特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰•二．几种重要的修饰反应•酶分子中经常被修饰的氨基酸残基侧链基团有：巯基，氨基，羧基，咪唑基，酚基，胍基，吲哚基，硫醚基及二硫键等。一．特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰1．巯基的化学修饰•巯基具有很强的亲核性，采用巯基化学修饰剂与酶蛋白侧链上的巯基结合，使巯基发生改变，从而改变酶的空间构象、特性和功能。•①烷基化试剂烷基试剂中用得最多的是碘乙酸，碘乙酰胺,巯基乙醇，谷胱甘肽(GSH)。E—SH+ICH2COOH(或ICH2CONH2)→E—S—CH2COOH(或E—S—CH2CONH2)+HI②汞试剂这类试剂如HgCl2，对氯汞苯甲酸(pCMB)和2—氯汞硝基苯酚等。2．氨基的化学修饰①乙酸酐修饰②2,4,6—三硝基苯磺酸修饰.③2,4—二硝基氟苯修饰(Sanger反应)④氨基的烷基化.这类试剂包括卤代乙酸,芳香卤和芳香磺酸等.⑤丹磺酰氯(DNS)修饰.⑥苯异硫氰酸酯(PITC)修饰(即Edman反应)3．羧基的化学修饰修饰羧基的反应专一性较差。常用水溶性碳化二亚胺修饰天冬氨酸和谷氨酸。可定量测定酶分子中羧基的数目。4．咪唑基的化学修饰常用修饰剂：碘乙酸、焦碳酸二乙酯等；其中焦碳酸二乙酯在近中性的条件下对组氨酸残基上的咪唑基具有较好的特异修饰能力，而且产物在240nm波长处有最大吸收峰，可以通过修饰得知分子中咪唑基的数量。5.胍基的化学修饰来源：Arg修饰反应：本质上是羰基对氨基酰基化。修饰剂：丁二酮二羰基化合物1，2－环己二酮苯乙二醛1．烷基化反应几种重要的修饰反应2．酰化及其相关反应3．氧化和还原反应4．芳香环取代反应•重要的修饰反应*•特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰*酰化及其相关反应烷基化反应氧化和还原反应芳香环取代反应巯基的化学修饰氨基的化学修饰羧基的化学修饰咪唑基的化学修饰胍基的化学修饰二硫基的化学修饰第三章酶的化学修饰•第一节什么是酶分子修饰•第二节化