流式细胞学考试答案(2014年)

1.流式细胞术应用于生物医学步骤包括哪些？①制备合格的单细胞悬液。②对所研究的细胞生物化学成分进行特异性荧光染色或标记，但对于单独光散射测量则不需染色。③流式细胞仪测定制备好的细胞悬液样品。④进行定量分析，所测数据一般用计算机自动化程序辅助分析。⑤对定量分析的结果，进行解释其在生物学方面意义。2.流式细胞术定量测量的理论依据是什么？影响FCM定量分析的因素有哪些？①定量测量的理论依据荧光是由对细胞进行染色的特异性荧光染料受激后而发射的，荧光测量的理论依据为：以细胞DNA含量测量为例。1）DNA含量的多少与吸收荧光染料分子的多少成正比。2）荧光强度与吸收荧光染料分子的多少成正比。3）荧光强度与通道数成正比。4）通道数与DNA含量成正比。②影响因素1）细胞悬液样品的影响。细胞碎片，团块，二连体细胞等。2）细胞的荧光染色，如染液的浓度.时间温度、PH值、细胞数的相对一致性等等。3）激光源的稳定性，要求光源的功率高，稳定性好，光场分布一致，为保证荧光脉冲的呈单峰的正态分布，激光的工作状态呈TEM00模式，其光场为单一的高斯分布。4）细胞流速的稳定性，使细胞通过激光区受照时间一致，使液流时刻处于稳定的分层鞘流和流速。5）FCM仪器的分辨率，FCM的分辨率的高低是以变异系数（CV值）的大小来描述，分辨率越高，仪器的灵敏度越高。如果一个细胞群体大小形状一致，荧光量一致，理想测量分布应该是一个又窄又尖的峰位，数学上通常用高斯分布或正态分布来描述。3.流式细胞仪检测的光信号包括哪些，并简述其代表的意义。当带有荧光的细胞通过激光照射区时，受激光激发产生荧光信号和光散射信号。①散射光信号（包括衍射光、折射光）1）前向角光散射（FSC）又称小角度散射，前向立体角大约为0.5-2.0°，FSC与被测细胞的大小/体积有关，确切的说与细胞直径密切相关。实际应用：用前向角散射光检测细胞相对大小及绝对大小；对检测细胞进行分群。2）侧向角光散射（SSC）SSC是指与激光束正交90度角的方向的光散射信号，SSC对细胞膜、胞质、细胞器和核膜的折射光的测量总和，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息②荧光信号：当激光光束激发被荧光染料标记的细胞时，就会产生荧光，荧光信号包括两种，自发性荧光和受激发射的标记荧光，1）自发性荧光：产生自发荧光的分子可能是正常细胞的组成成分如核黄素、细胞色素等。这些成分在较大的细胞中含量较多，相应的自发荧光也就强一些。培养的细胞中死细胞比活细胞的自发荧光要强，有些学者也用自发荧光来区别死活细胞。2）受激发射的标记荧光：细胞中标记的荧光染料受激光激发后产生的发射光，这些光的强度代表了重要的细胞参量，通过对光强度的检测从而反映所测细胞参量的量。4.简述流式细胞仪荧光测量通常的数据采集方式？荧光测量通常的数据采集方式有两种：①数据线性（LINEAR）采集方式：这是荧光测量通常使用的方式，即放大器的输出和输入是线性（2；4；8；16…）关系，输入信号放大几倍，输出信号也放大几倍，线性采集方式常适用于信号强度变化较小，代表生物学线性特征的信号（如DNA含量）。FSC也常用线性放大测量。②对数（LOG）采集方式：对数放大器，它的输出与输入是对数关系。如果原来输出为1，当输入增大到原来的10倍时，输出是2；当输入又增大10倍时，输出为3，等等。对数采集方式是免疫学定量分析常用的数据采集方式，主要是为了使荧光标记较小群体的细胞能与标记较大群体细胞同时显示出来。5.简述流式细胞术数据显示方式？通常有一维显示，二维显示和三维显示。①单参数分析：直方图显示（一维显示），图中X轴代表荧光信号或散射光信号的强度，以通道数表示，通道数和光强度之间的关系既可以是线性关系，也可以是对数关系；Y轴代表该通道内所出现具有相同光信号特性细胞的频度，一般为相对细胞数。单参数分析只能表达具有同一特征细胞的数量及其荧光表达的强度。②多参数分析：多参数分析可有效提高分析结果的准确性，从多个角度对细胞的异质性进行研究。1）二维散点图当对2个以上的参数进行分析时，其表达方式主要为散点图。X轴代表了前向角散射光的强度，Y轴代表了侧向角散射光的强度。2）二维等高线图等高线图是一种可以同时表达检测参量和细胞频度的方式，它类似于地图中所使用的等高线，把代表相同细胞数目的点依次连接起来形成密闭曲线，越在里面的曲线所代表的细胞数目越多，因此等高线密集的地方也就是细胞数目变化最快的地方3）假三维图假三维图并非用来显示3个检测参数，而只是在二维双参数的基础上以细胞数目为Z轴，展示立体的二维细胞分布，故称为假三维图。主要目的是为了使图显得更加直观。4）三维图任意选3个参数（如FSC、SSC、FL1、FL2、FL3、FL4等)为XYZ轴构成一个三维图。在三维空间中，每一群细胞各处于独立的空间位置。三维图对复杂的细胞亚群分析更为直观、准确，但对其数据的统计分析较难。5）多参数组合分析现代流式细胞仪对多参数的检测可以通过“设门”技术选择特定的观察目标，然后再以多个双参量散点图的组合加以分析。多参数分析能比较各种细胞的抗原表达水平，需要时可统计出各种细胞亚群的数量或百分比、平均荧光强度等，多种信息。